熊美華，諶建平，操潤(rùn)琴，萬(wàn)金華，操 建

（1.南昌市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院耳鼻喉科，江西 南昌 330000；2.南昌市洪都中醫(yī)院，江西 南昌 330008）

喉癌是頭頸部腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，以鱗狀細(xì)胞癌為主，約占95%，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程[1]。近年來(lái)其發(fā)病率呈逐步上升趨勢(shì)，常造成患者發(fā)音及吞咽困難。常用的治療手段包括：外科手術(shù)方法、化療藥物、放射治療和生物治療[2]。一般認(rèn)為，喉癌具有侵襲力強(qiáng)、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移以及預(yù)后差的特點(diǎn)。因此提高患者生存率需要增加對(duì)喉鱗癌發(fā)病及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。

薏苡仁為禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁，俗稱米仁，又名薏米、苡仁等。現(xiàn)代研究表明，薏苡仁含有多種活性成分，如脂類、多糖類、木脂素類、酚類和腺苷等化合物。薏苡

仁在中醫(yī)被用作利水滲濕藥，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗?jié)?、降血糖和抗腫瘤等藥理作用。目前對(duì)薏苡仁油的研究主要集中在其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡作用[3-4]，然而薏苡仁油對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移的作用報(bào)告較少，尤其對(duì)喉鱗癌細(xì)胞的侵襲與遷移作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)探討薏苡仁油對(duì)喉癌細(xì)胞株Hep-2侵襲和遷移能力的影響，為薏苡仁油調(diào)控喉鱗癌的侵襲遷移機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 喉癌細(xì)胞株Hep-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，DMEM/F12、胰蛋白酶培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，Transwell小室（8.0μm孔徑PC膜）購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Transwell Kit購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司，E-cad、Vimentin、Slug、pERK1/2、ERK1/2、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，薏苡仁油購(gòu)自浙江豪森藥物股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 選用喉癌細(xì)胞株Hep-2，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃恒溫、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有細(xì)胞株從液氮中取出后進(jìn)行復(fù)蘇，置入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶約80%時(shí)進(jìn)行傳代，所有細(xì)胞常規(guī)傳代2次，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好無(wú)污染的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK8實(shí)驗(yàn) 取狀態(tài)良好的Hep-2細(xì)胞，胰酶消化后，離心，重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×103個(gè)細(xì)胞/ml，在96孔板中按100 μl/孔加入細(xì)胞懸液，混合均勻，所有組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)無(wú)細(xì)胞組的空白孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。去除原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度薏苡仁油（0、25、50、100、200、400、800、1 600 μM）的新鮮培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，去除原培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，每孔分別加入10 μl的CCK-8溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，取出96孔板，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度值（波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm）。數(shù)據(jù)處理：根據(jù)吸光度值計(jì)算各組細(xì)胞的吸光值均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。使用Graphpad Prism軟件繪圖。抑制率=[1-（Atreated-Ablank）/（Acontrol-Ablank）]×100%。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右，加入不同濃度薏苡仁油處理24 h后，用1 ml槍頭在6孔板各孔中央位置，劃1道劃痕，盡量使各孔的細(xì)胞劃痕寬度一致。PBS漂洗3次，去除劃下的細(xì)胞碎片。每孔加入1%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基2 ml，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。觀察24 h后細(xì)胞遷移情況并拍照記錄，遷移距離測(cè)量采用Image J軟件。

1.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 取經(jīng)過(guò)不同濃度薏苡仁油處理24小時(shí)后細(xì)胞，消化離心后用無(wú)血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞的密度為5×105個(gè)細(xì)胞/ml，小室上部加入200 μl細(xì)胞懸液，小室下部加入750 μl含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，去除上下室培養(yǎng)基，PBS清洗小室，將小室置入4%多聚甲醛中固定細(xì)胞10 min，室溫下晾干小室，用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，避光，DAPI染色10 min，去離子水洗滌后風(fēng)干，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)取五個(gè)視野計(jì)數(shù)穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)，每組細(xì)胞重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 取經(jīng)過(guò)不同濃度薏苡仁油處理24 h后細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，低溫高速離心后收集上清液，BCA法測(cè)蛋白濃度。將已配制好的蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，每個(gè)孔上樣體積為20 μl，兩側(cè)加入Marker，在Bio-Rad凝膠電泳槽中進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；室溫下脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，ECL免疫印跡底物進(jìn)行發(fā)光顯影、掃描。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果，所有數(shù)據(jù)采用“x±s”表示。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）；兩組數(shù)據(jù)采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 薏苡仁油抑制喉癌細(xì)胞株Hep-2的增殖 從圖1可以看出，薏苡仁油抑制喉癌細(xì)胞株Hep-2的增殖，其抑制效應(yīng)呈劑量-時(shí)間依賴性。薏苡仁油作用于同一時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比（0 μM），隨著薏苡仁油濃度的升高（25～1 600 μM），Hep-2生長(zhǎng)抑制率顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；薏苡仁油對(duì)喉癌細(xì)胞株Hep-2的半數(shù)抑制濃度（IC50）為：165.2～650.2 μM，見(jiàn)表1?；谝陨系慕Y(jié)果，我們選擇作用24 h的100，200 μM薏苡仁油濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

圖1 薏苡仁油抑制喉癌細(xì)胞株Hep-2的增殖Figure1 Coix seed oil inhibited the proliferation of Hep-2 cells

表1 薏苡仁油作用后Hep-2的IC50值Table1 The IC50 values of Hep-2 after added the Coix seed oil

2.2 薏苡仁油抑制喉癌細(xì)胞株Hep-2的侵襲和遷移 我們采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)薏苡仁油對(duì)喉癌細(xì)胞株Hep-2遷移能力的影響，從圖2A-B可以看出，采用不同濃度薏苡仁油（100，200μM）處理細(xì)胞24 h后，薏苡仁油組劃痕區(qū)變窄，對(duì)照組組劃痕依然明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

采用含基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)薏苡仁油對(duì)喉癌細(xì)胞株Hep-2侵襲能力的影響，采用不同濃度薏苡仁油（100，200 μM）處理細(xì)胞24 h后，薏苡仁油組穿膜細(xì)胞數(shù)目顯著下降，即其侵襲能力明顯受抑制（圖2C-D），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 薏苡仁油抑制喉癌細(xì)胞株Hep-2的侵襲和遷移Figure2 Coix seed oil inhibited the invasive and migrative ability on Hep-2 cells

2.3 薏苡仁油對(duì)喉癌細(xì)胞株Hep-2侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá) Western bolt免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示：采用不同濃度薏苡仁油（100，200 μM）處理細(xì)胞 24 h后，Vimentin、Slug、pERK1/2表達(dá)下調(diào)；E-cad表達(dá)升高；ERK1/2表達(dá)不變，見(jiàn)圖3。

圖3 薏苡仁油對(duì)喉癌細(xì)胞株Hep-2侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)Figure3 The protein levels of EMT related genes after added the different concentrations of Coix seed oil

3 討論

喉癌是喉部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，我國(guó)（2003～2007年）喉癌發(fā)病率為2.04/10萬(wàn)，占全部惡性腫瘤新發(fā)病例的0.77%[5]。雖然喉癌的治療主要以手術(shù)及放療為主，但是近年來(lái)，術(shù)后化療或者術(shù)前誘導(dǎo)化療可以減低喉癌局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是術(shù)前誘導(dǎo)化療可以改善患者的生活質(zhì)量[5-6]。

薏苡仁含有多種活性成分，如脂類、多糖類、木脂素類、酚類和腺苷等化合物。薏苡仁在中醫(yī)被用作利水滲濕藥，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗?jié)儭⒔笛呛涂鼓[瘤等藥理作用。目前對(duì)薏苡仁油的研究主要集中在增殖和凋亡方面。車曉玲等[4]研究發(fā)現(xiàn)，薏苡仁油可協(xié)同奧沙利鉑抑制人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。有學(xué)者研究表明薏苡仁注射液抗腫瘤的可能機(jī)制有：抑制細(xì)胞周期，使細(xì)胞周期阻滯于G2+M期，減少進(jìn)入G0、G1時(shí)相細(xì)胞，使DNA合成期（S期）比例減少，從而減少有絲分裂，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7]；谷滿倉(cāng)等[8]在胰腺癌細(xì)胞系BXPC3中發(fā)現(xiàn)薏苡仁脂可能通過(guò)逆轉(zhuǎn)吉西他濱誘導(dǎo)的抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin表達(dá)上調(diào)，并增加Bax/Bcl-2比值，從而進(jìn)一步激活Caspase-3蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞株BXPC3的生長(zhǎng)抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用。沈飛瓊等[9]通過(guò)對(duì)抑瘤率及 MVD、VEGF、KDR蛋白及mRNA的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)康萊特（薏苡仁油）及吉非替尼單藥均能產(chǎn)生一定的抗腫瘤作用，而康萊特聯(lián)合吉非替尼具有協(xié)同增效作用，且能夠顯著降低腫瘤組織血管生成數(shù)目。國(guó)內(nèi)對(duì)與薏苡仁油的研究較多，而國(guó)外的研究較少，Liu等[10]采用不同濃度康萊特注射液對(duì)小鼠皮下胰腺癌細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn)表明：薏苡仁油能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤的凋亡，并且可以下調(diào)p-AKT及p-mTOR的表達(dá)來(lái)影響PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路。Zhan等[11]通過(guò)對(duì)胃癌化療患者分組對(duì)比研究顯示，采用薏苡仁油聯(lián)合化療藥物組患者的療效，生活質(zhì)量，毒副作用，胃腸道反應(yīng)和骨髓抑制作用明顯比只采用化療藥物組低。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，薏苡仁油抑制喉癌細(xì)胞株Hep-2的增殖，其抑制效應(yīng)呈劑量-時(shí)間依賴性；薏苡仁油對(duì)喉癌細(xì)胞株Hep-2的半數(shù)抑制濃度（IC50）為：165.2～650.2 μM；經(jīng)薏苡仁油作用后Hep-2細(xì)胞的侵襲和遷移能力降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；薏苡仁油（100，200 μM）作用后，與對(duì)照組相比，Vimentin、Slug、pERK1/2的表達(dá)下調(diào)；E-cad的表達(dá)升高；ERK1/2的表達(dá)不變。

綜上所述，薏苡仁油可以抑制喉鱗癌的侵襲和遷移，并初步闡明了可以通過(guò)調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）來(lái)抑制喉鱗癌的侵襲遷移，上述研究為薏苡仁油抑制喉鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 王蓓蕾,徐立紅,袁暉,等.喉癌相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2014(9):1323-1330.

[2] 劉家鋒.不同手術(shù)方式治療喉癌的預(yù)后研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2017,23(28):59-60.

[3] 胡靜,馬力天,閆平,等.康萊特聯(lián)合順鉑對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,14(10):1865-1870.

[4] 車曉玲,李進(jìn),何敬東,等.康萊特注射液聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)SW480細(xì)胞株增殖和凋亡的影響[J].腫瘤,2011,31(4):321-325.

[5] 張樹(shù)榮,房居高.誘導(dǎo)化療在局部晚期喉癌治療中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2015,9(4):655-659.

[6] 趙舒薇.喉癌治療進(jìn)展[J].腫瘤學(xué)雜志,2012,18(9):644-647.

[7] 李大鵬.康萊特注射液抗癌作用機(jī)理研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理,2001,12(2):122-124.

[8] 谷滿倉(cāng),錢亞芳,孫悅,等.薏苡仁脂調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及Survivin增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2013,29(4):491-495.

[9] 沈飛瓊,魏素菊,洪雷,等.康萊特聯(lián)合吉非替尼對(duì)Lewis肺癌小鼠血管生成的影響[J].腫瘤,2013,33(12):1047-1053.

[10]Liu Y,Zhang W,Wang XJ,et al.Antitumor effect of Kanglaite(R)injectioninhumanpancreatic cancer xenografts[J].BMC Complement Altern Med,2014,14:228.

[11]Zhan YP,Huang XE,Cao J,et al.Clinical safety and efficacy of Kanglaite(R)(Coix Seed Oil)injection combined with chemotherapy in treating patients with gastric cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(10):5319-5321.