段春慧 湯新明 張思新 胡丹丹 索 勛 劉賢勇

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriaspp.)是包括弓形蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)、住肉孢子蟲(chóng)等在內(nèi)的頂復(fù)門原蟲(chóng)中的一大類胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)。不同蟲(chóng)種的艾美耳球蟲(chóng)感染多種畜禽，尤其感染雞的艾美耳球蟲(chóng)對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失(李祥瑞, 2011)。長(zhǎng)期以來(lái)，球蟲(chóng)病的防治以藥物為主，耐藥性及藥物殘留問(wèn)題逐漸顯現(xiàn)。雞球蟲(chóng)活卵囊疫苗經(jīng)歷了強(qiáng)毒苗、弱毒苗的發(fā)展并得到廣泛應(yīng)用，其中弱毒活卵囊疫苗雖具備高效、安全等優(yōu)點(diǎn)，但生產(chǎn)成本較高。因此，開(kāi)發(fā)新型抗球蟲(chóng)藥物及疫苗迫切需要尋找艾美耳球蟲(chóng)的特異性藥物靶點(diǎn)或是抗原分子 (劉賢勇等, 2014)。

20世紀(jì)70年代基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為新的里程碑，標(biāo)志著人類認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并主動(dòng)改造生命的新時(shí)期開(kāi)始。Berg等將SV40病毒DNA與噬菌體P22 DNA在體外重組成功，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (Jacksonetal., 1972)，使本來(lái)在真核生物中合成的蛋白質(zhì)能在細(xì)菌中合成，打破了種屬界限。在剛地弓形蟲(chóng)和惡性瘧原蟲(chóng)成功實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(Goonewardeneetal., 1993; Soldatietal., 1993)，使頂復(fù)門原蟲(chóng)的基因操作技術(shù)也從醞釀期進(jìn)入發(fā)展時(shí)期。頂復(fù)門不同原蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因研究取得的突破和進(jìn)展，使轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為研究頂復(fù)門原蟲(chóng)入侵、代謝等相關(guān)基因功能、研制新型疫苗 (如活載體疫苗和DNA疫苗) 和篩選新的藥物靶基因等方面的有力工具。而艾美耳球蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因研究也緊跟步伐進(jìn)入探索階段。

隨著艾美耳球蟲(chóng)基因組分析研究的向前推進(jìn)，其研究即將或已經(jīng)進(jìn)入后基因組時(shí)代。對(duì)艾美耳球蟲(chóng)基因及其基因產(chǎn)物的功能研究是發(fā)現(xiàn)有效疫苗和抗球蟲(chóng)藥物作用靶位的必要前提，而轉(zhuǎn)染技術(shù)將成為基因操作的有力工具。以往基因功能的研究局限于已知功能基因的比較和間接地推測(cè)，艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用使球蟲(chóng)基因表達(dá)調(diào)控、藥物抗性研究以及疫苗的研究進(jìn)入嶄新的發(fā)展時(shí)期。本文將對(duì)轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲(chóng)的研究工作進(jìn)行回顧和展望。

1 艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立與發(fā)展

1.1 艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的探索

自1993年，轉(zhuǎn)基因技術(shù)首次在弓形蟲(chóng)成功報(bào)道以來(lái)，其他頂復(fù)門原蟲(chóng)的轉(zhuǎn)染研究相繼展開(kāi)。而艾美耳屬球蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)起步較晚，至1998年，Kelleher等 (1998) 才首次使用報(bào)告基因β-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，這也是對(duì)艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因操作的初步嘗試。但因艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染效率較低,其轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展受到一定程度的制約。郝力力等 (2007) 利用表達(dá)黃色、紅色熒光蛋白的質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)不同發(fā)育階段蟲(chóng)體內(nèi)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，為艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。因艾美耳球蟲(chóng)代表性蟲(chóng)株——柔嫩艾美耳球蟲(chóng)盲腸寄生的特點(diǎn)，利用泄殖腔接種轉(zhuǎn)染后的子孢子成功實(shí)現(xiàn)了其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 (Yanetal., 2009)，同樣的和緩艾美耳球蟲(chóng)也利用此種策略取得成功 (Qinetal., 2014)。與此同時(shí)，一方面我們實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)了巨型艾美耳球蟲(chóng)、早熟艾美耳球蟲(chóng)、堆型艾美耳球蟲(chóng)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 (Zouetal., 2009)；另一方面，我們也通過(guò)翅靜脈接種堆型艾美耳球蟲(chóng)子孢及泄殖腔接種毒害艾美耳球蟲(chóng)二代裂殖子成功實(shí)現(xiàn)了堆型、毒害艾美耳球蟲(chóng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 (未發(fā)表數(shù)據(jù))。

在轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展的過(guò)程中，球蟲(chóng)研究者還對(duì)其他宿主寄生的艾美耳球蟲(chóng)進(jìn)行了轉(zhuǎn)染嘗試。如寄生于大鼠的尼氏艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染后的子孢子經(jīng)口接種至胃酸中和的大鼠而成功轉(zhuǎn)染 (Kurthetal., 2009)。而兔球蟲(chóng)中的斯氏艾美耳球蟲(chóng)、腸艾美耳球蟲(chóng)、中型艾美耳球蟲(chóng)、大型艾美耳球蟲(chóng)和黃艾美耳球蟲(chóng)則通過(guò)外科手術(shù)將轉(zhuǎn)染后的子孢子直接接種于腸道而轉(zhuǎn)染成功 (Shietal., 2016; Taoetal., 2017；未發(fā)表數(shù)據(jù))。不同球蟲(chóng)蟲(chóng)種的成功轉(zhuǎn)染(圖1)大大推動(dòng)了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在艾美耳球蟲(chóng)中的發(fā)展與應(yīng)用。

1.2 艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染技術(shù)的優(yōu)化與發(fā)展

因艾美耳屬球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染效率較低、體外培養(yǎng)困難及生活史復(fù)雜等眾多因素的限制使轉(zhuǎn)基因技術(shù)在艾美耳球蟲(chóng)的發(fā)展明顯滯后于頂復(fù)門其他原蟲(chóng)。因此優(yōu)化艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染顯得尤為重要，其中優(yōu)化轉(zhuǎn)染載體和轉(zhuǎn)染方法是優(yōu)化轉(zhuǎn)染技術(shù)的兩大核心部分。

1.2.1球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染流程: 優(yōu)化雞球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染技術(shù)，首先要了解雞球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染流程。自成功實(shí)現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以來(lái)，艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染技術(shù)取得一定程度的發(fā)展。根據(jù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)的研究結(jié)果及經(jīng)驗(yàn)，特將其轉(zhuǎn)染流程簡(jiǎn)單總結(jié)如下：(1) 構(gòu)建含有目的基因調(diào)控序列的報(bào)告基因載體。一般而言用于頂復(fù)門原蟲(chóng)轉(zhuǎn)染的載體是由啟動(dòng)子、3’轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控序列以及兩者之間的一個(gè)完整開(kāi)放閱讀框組成。不同基因的啟動(dòng)子可以共用同一個(gè)3’轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控序列。例如柔嫩艾美耳球蟲(chóng)MIC1和組蛋白4啟動(dòng)子可共用Actin3’轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列 (Yanetal., 2009; Yinetal., 2011)。(2) 使用AMAXA Nucleofector系統(tǒng)中U-033程序或電穿孔方法轉(zhuǎn)染經(jīng)限制性內(nèi)切酶線性化后的質(zhì)粒及純化后的子孢子 (裂殖子) 并使用DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。研究證實(shí)線性化質(zhì)粒比環(huán)形質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率高，因此轉(zhuǎn)染前要對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行線性化。(3) 轉(zhuǎn)染后的子孢子 (裂殖子) 接種MDBK細(xì)胞于24 h后觀察轉(zhuǎn)染成功與否或者接種至雞體內(nèi) (泄殖腔、靜脈接種或手術(shù)) 經(jīng)3～5代流式聯(lián)合藥物傳代篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染群體。但這種轉(zhuǎn)基因群體的遺傳性狀仍然是不一致的，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)的隨機(jī)性。(4) 轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)鑒定。經(jīng)篩選后的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染群體利用多種監(jiān)測(cè)手段如免疫印跡 (Western Blot) 和間接免疫熒光 (Indirect Immunofluorescent Assay) 等鑒定外源蛋白的表達(dá)，同時(shí)用染色體步移 (Genome Walking) 或質(zhì)粒拯救 (Plasmid Rescue) 或DNA測(cè)序等來(lái)確定轉(zhuǎn)基因在球蟲(chóng)染色體上的整合位點(diǎn)。(5) 利用單孢子囊分離甚是單子孢子分離技術(shù)獲得遺傳一致的轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲(chóng)系。經(jīng)流式和藥物聯(lián)合篩選獲得的轉(zhuǎn)基因群體，其遺傳性狀仍不穩(wěn)定，因此需要進(jìn)行單孢子囊 (子孢子) 分離。我們實(shí)驗(yàn)室通過(guò)單孢子囊分離技術(shù)獲得了一株遺傳性能一致的轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)系——表達(dá)黃色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)株EtM2e (Liuetal., 2013)。

圖1 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的艾美耳球蟲(chóng)種類Fig.1 The Eimeria species been successfully transfected

1.2.2轉(zhuǎn)染載體的優(yōu)化：載體是轉(zhuǎn)染技術(shù)的核心部分之一，優(yōu)化轉(zhuǎn)染載體是提高轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵。頂復(fù)門原蟲(chóng)轉(zhuǎn)染最初多用環(huán)形粒。Kelleher等 (1998) 首次報(bào)道的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染使用的也是環(huán)形質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染效率僅為10-4～10-6。而經(jīng)過(guò)不斷探索，Black等 (1995) 將限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合轉(zhuǎn)染應(yīng)用于弓形蟲(chóng)中并實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染效率提高了10～100倍，為提高艾美耳球蟲(chóng)的轉(zhuǎn)染效率提供了借鑒。之后，研究者借鑒限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合轉(zhuǎn)染，探究了分別表達(dá)黃色熒光蛋白和藥物篩選基因的質(zhì)粒在球蟲(chóng)中共用的可行性，流式分選與藥物篩選的結(jié)合顯著提高了球蟲(chóng)的轉(zhuǎn)染效率，自此轉(zhuǎn)染效率提高近200倍 (Liuetal., 2008; Yanetal., 2009)，該項(xiàng)技術(shù)的突破，極大地促進(jìn)了各部調(diào)控元件的優(yōu)化。此外，利用雙框表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)外源基因在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)中的表達(dá) (Yinetal., 2011)，為利用雙框表達(dá)策略啟動(dòng)不同外源抗原提供有益探索。國(guó)外研究者將藥篩基因 (TgDHFR-TS)與熒光蛋白融合表達(dá) (Hanigetal., 2012)，簡(jiǎn)化轉(zhuǎn)染載體，提高轉(zhuǎn)染效率，極大地加快了篩選速度。

此外，研究表明piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)也可以應(yīng)用于艾美耳球蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因研究，被整合至基因組的DNA分子的特異性位點(diǎn)為TTAA，符合其轉(zhuǎn)座特征，并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的球蟲(chóng)群體 (Suetal., 2012)，因此piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將有可能進(jìn)一步提高球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染效率，那么piggyBac 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在艾美耳球蟲(chóng)的應(yīng)用不失為一種優(yōu)化方向。近來(lái)將豬捷申病毒的自剪切序列P2A引入球蟲(chóng)表達(dá)載體后實(shí)現(xiàn)了同一表達(dá)框中兩個(gè)外源基因的非融合表達(dá) (Tangetal., 2016)，為表達(dá)多基因的轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)奠定良好基礎(chǔ)，同時(shí)利用SAG13強(qiáng)啟動(dòng)子顯著提高了其調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，這也是提升轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)表達(dá)異源抗原水平的有益嘗試。因此，不斷優(yōu)化的載體促進(jìn)了轉(zhuǎn)染效率的提升，從而促進(jìn)艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染技術(shù)穩(wěn)步發(fā)展。

1.2.3轉(zhuǎn)染方法的優(yōu)化：目前的轉(zhuǎn)染方法主要有電穿孔轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射、基因槍等方法，而在頂復(fù)門原蟲(chóng)研究中應(yīng)用較廣泛的是電穿孔轉(zhuǎn)染。最初的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染主要應(yīng)用電穿孔轉(zhuǎn)染方法，然而較低的轉(zhuǎn)染效率促使人們?nèi)ヌ剿餍碌霓D(zhuǎn)染方法來(lái)改變這一現(xiàn)狀?；陔姶┛邹D(zhuǎn)染的AMAXA Nucleofector轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的出現(xiàn)，顯著提高了細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，并且可適用于艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染。AMAXA Nucleofector是綜合應(yīng)用傳統(tǒng)的電穿孔技術(shù)及細(xì)胞特異性細(xì)胞核轉(zhuǎn)染液，通過(guò)調(diào)整優(yōu)化的電轉(zhuǎn)參數(shù)，直接把外源基因?qū)朐?xì)胞及細(xì)胞系的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的一項(xiàng)技術(shù)。在轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)研究中，國(guó)外球蟲(chóng)研究者Clark等 (2008) 首先利用AMAXA Nucleofector轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中的U-033程序結(jié)合限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染顯著提高球蟲(chóng)的轉(zhuǎn)染效率, AMAXA Nucleofector系統(tǒng)是優(yōu)化球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染方法的重要一步。

1.2.4艾美耳球蟲(chóng)卵囊轉(zhuǎn)染嘗試：由于子孢子轉(zhuǎn)染操作較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)也進(jìn)行了其他轉(zhuǎn)染方法的嘗試?；谧渔咦愚D(zhuǎn)染受到眾多限制，研究者一直在探索卵囊轉(zhuǎn)染方法以簡(jiǎn)化繁瑣的球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染程序。利用基因槍技術(shù)轉(zhuǎn)染未孢子化卵囊后可以檢測(cè)到外源基因的插入，這是優(yōu)化球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染程序的一次大膽嘗試 (Lietal., 2012)。利用病毒載體介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)轉(zhuǎn)染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)未孢子化卵囊 (Wangetal., 2017; Xinetal., 2018) 也是繼基因槍技術(shù)之后卵囊轉(zhuǎn)染的又一有益嘗試。盡管現(xiàn)階段的轉(zhuǎn)染方法大幅度提升了轉(zhuǎn)染效率，但也受到眾多限制。因此我們?nèi)皂毑粩鄧L試與探索新的方法使球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)質(zhì)的飛躍。

1.3 球蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)面臨的問(wèn)題與挑戰(zhàn)

盡管當(dāng)前艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染已經(jīng)取得了突破性的研究進(jìn)展，但在基因操作技術(shù)和轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)的應(yīng)用方面仍面臨諸多挑戰(zhàn)。低轉(zhuǎn)染效率一直是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究艾美耳球蟲(chóng)的主要屏障，這就要求我們提高轉(zhuǎn)染效率并簡(jiǎn)化轉(zhuǎn)染步驟。首先轉(zhuǎn)染效率問(wèn)題是制約基因操作技術(shù)在球蟲(chóng)應(yīng)用的重要一環(huán)。盡管限制性內(nèi)切酶及球蟲(chóng)內(nèi)源性強(qiáng)啟動(dòng)子的應(yīng)用使球蟲(chóng)的轉(zhuǎn)染效率從最開(kāi)始的10-4～10-6提升了百倍，但其轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)低于弓形蟲(chóng)等頂復(fù)門其他原蟲(chóng)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)特定基因的過(guò)表達(dá)、敲除、插入及突變略顯艱難，嚴(yán)重制約球蟲(chóng)基因操作技術(shù)的發(fā)展。其次因艾美耳屬球蟲(chóng)體外培養(yǎng)較為困難，必須借助動(dòng)物完成轉(zhuǎn)染后球蟲(chóng)的生活史。眾多的不可控因素，使球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染研究的步伐被迫放緩。再次，對(duì)子孢子進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力且使用范圍具有一定的局限性，因此尋求更為便捷的轉(zhuǎn)染方法是優(yōu)化球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染的必要環(huán)節(jié)。目前，直接轉(zhuǎn)染卵囊或者孢子囊就是最值得期待的技術(shù)突破。并且已利用基因槍、病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染體系進(jìn)行卵囊轉(zhuǎn)染的探索 (Lietal., 2012; Wangetal., 2017)。此外，球蟲(chóng)作為疫苗載體的研究尚處于初級(jí)階段，轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)表達(dá)外源蛋白的量一直是大家關(guān)注并不斷探索的節(jié)點(diǎn)。因此，在優(yōu)化艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染技術(shù)的道路上仍需要不斷探索與嘗試，以推進(jìn)遺傳操作技術(shù)在球蟲(chóng)的發(fā)展。

2 艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

2.1 轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲(chóng)作為疫苗活載體

自1983年誕生第一個(gè)轉(zhuǎn)基因生物煙草以來(lái)，大大推動(dòng)了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，尤其是在疫苗開(kāi)發(fā)領(lǐng)域顯示了越來(lái)越光明的前景。近年來(lái)隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，獸用疫苗的研制和開(kāi)發(fā)獲得了快速發(fā)展。其中基因工程活載體疫苗因其可同時(shí)啟動(dòng)機(jī)體體液和細(xì)胞免疫并且可以構(gòu)成多價(jià)乃至多聯(lián)疫苗，使之成為近幾年來(lái)新型疫苗研制最為活躍，也是最有希望的發(fā)展方向。基于球蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，將轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)開(kāi)發(fā)作為活載體將成為研究活載體疫苗的有力工具。

在研究轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)針對(duì)表達(dá)異源蛋白甚至是球蟲(chóng)自身蛋白激發(fā)宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了逐步探索。有研究發(fā)現(xiàn)，與黃色熒光蛋白表達(dá)定位于胞漿的轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)相比，黃色熒光蛋白表達(dá)并分泌至帶蟲(chóng)空泡的轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)能激發(fā)更好的黏膜IgA應(yīng)答 (Huangetal., 2011)，為轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)的免疫應(yīng)答研究提供了很好的技術(shù)平臺(tái)。國(guó)外研究者發(fā)現(xiàn)，表達(dá)空腸彎曲桿菌保護(hù)性抗原CjaA的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)對(duì)免疫雞群能提供部分抵抗空腸彎曲桿菌感染的免疫保護(hù) (Clarketal., 2012)，為艾美耳球蟲(chóng)作為禽病疫苗載體提供了直接證據(jù)。此外有研究顯示，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)表達(dá)的傳染性法氏囊病毒VP2抗原和傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白抗原可被宿主的免疫系統(tǒng)所識(shí)別并使雞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答 (Marugan-Hernandezetal., 2016)。同時(shí)因頂復(fù)門原蟲(chóng)基因的保守性，表達(dá)頂復(fù)門其他原蟲(chóng)的蛋白并不存在密碼子偏好性，如柔嫩艾美耳球蟲(chóng)表達(dá)弓形蟲(chóng)SAG1蛋白 (Tangetal., 2016)，能夠激發(fā)抗弓形蟲(chóng)感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答，推動(dòng)了將球蟲(chóng)改造為禽類其他重大疫病病原的疫苗載體的發(fā)展。

在表達(dá)其他艾美耳球蟲(chóng)抗原基因的構(gòu)建和測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)表達(dá)巨型艾美耳球蟲(chóng)的profilin、AMA1及IMP1基因分別刺激機(jī)體產(chǎn)生抗巨型艾美耳球蟲(chóng)的免疫保護(hù) (Tangetal., 2018a; 2018b)，從而為減少疫苗組分、降低成本奠定基礎(chǔ)。而基于不同艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)種免疫原性的差異、通過(guò)導(dǎo)入外源佐劑分子提高艾美耳球蟲(chóng)免疫原性的研究結(jié)果證實(shí)，雞的細(xì)胞因子 (如IL-2) 和IgY Fc片段可分別作為分子佐劑顯著增強(qiáng)球蟲(chóng)的免疫原性 (Lietal., 2015; Qinetal., 2016)。

2.2 利用轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲(chóng)進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究

基因調(diào)控是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的中心課題之一。生物體內(nèi)的基因在轉(zhuǎn)錄、剪切、翻譯以及轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子之前的所有加工過(guò)程都是受著精細(xì)機(jī)制的調(diào)控。要了解艾美耳屬球蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及生物學(xué)功能，就必須搞清楚基因表達(dá)調(diào)控的時(shí)間和空間概念。雞球蟲(chóng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的實(shí)現(xiàn)，加速了基因表達(dá)調(diào)控的研究。利用表達(dá)報(bào)告基因的時(shí)間和強(qiáng)度，可以篩選到階段特異性表達(dá)的優(yōu)秀啟動(dòng)子和持續(xù)性表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子。例如柔嫩艾美耳球蟲(chóng)表面抗原蛋白SAG13的調(diào)控序列能顯著提高其調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，但其在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)未孢子化階段不能啟動(dòng)熒光蛋白的表達(dá) (Tangetal., 2016)，而在兔黃艾美耳球蟲(chóng)和鐮型艾美耳球蟲(chóng)所有生活史階段均啟動(dòng)熒光蛋白的表達(dá)。此外，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的MIC-1也屬于在未孢子化階段不能驅(qū)動(dòng)熒光蛋白表達(dá)的階段性啟動(dòng)子 (Yinetal., 2011)。Actin和組蛋白4基因啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)熒光蛋白在球蟲(chóng)孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖階段持續(xù)性地高表達(dá) (Shietal., 2008; Yanetal., 2009)。因此,通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)可以鑒定和篩選種特異性或種間保守性啟動(dòng)和終止調(diào)控序列，使其成為研究基因表達(dá)調(diào)控的有力工具。

2.3 利用轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲(chóng)進(jìn)行功能基因研究

以往基因功能的研究局限于已知功能基因的比較和間接地推測(cè)，近年來(lái)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在球蟲(chóng)的應(yīng)用加速了基因功能研究的準(zhǔn)確化，使雞球蟲(chóng)基因的研究現(xiàn)狀大為改觀。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以直觀準(zhǔn)確的了解相關(guān)功能蛋白在蟲(chóng)體細(xì)胞內(nèi)的定位與分布。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)組蛋白4基因的核定位序列能將黃色熒光蛋白定位到球蟲(chóng)子孢子、裂殖子、未孢子化卵囊等階段蟲(chóng)體的核中 (Liuetal., 2008; Yanetal., 2009)。而弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白GRA8和瘧原蟲(chóng)RIFIN蛋白的信號(hào)肽序列能夠?qū)ⅫS色熒光蛋白分泌到帶蟲(chóng)空泡內(nèi) (Shietal., 2009)。此外，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的膜錨定序列GPI及MCP2序列分別能夠?qū)⑼庠吹鞍锥ㄎ坏阶渔咦幽ど虾臀⒕€體上 (Marugan-Hernandezetal., 2017a; Marugan-Hernandezetal., 2017b)。另一方面，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以從分子水平上弄清控制入侵、運(yùn)動(dòng)、代謝、致病性和宿主特異性等生物學(xué)功能的重要基因。而基于CRISPR/Cas9 的基因編輯技術(shù)在球蟲(chóng)的不斷探索將能夠?qū)τ诨蚬δ苎芯康耐茰y(cè)進(jìn)行有效驗(yàn)證 (Barrangouetal., 2014)。隨著艾美耳球蟲(chóng)全基因組測(cè)序的推進(jìn)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)將成為研究艾美耳球蟲(chóng)基因功能的重要工具。

2.4 利用轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲(chóng)進(jìn)行耐藥性和新藥物靶基因研究

長(zhǎng)期以來(lái)，球蟲(chóng)病的防治以藥物為主，耐藥性及藥物殘留問(wèn)題日益突出。因此，揭示耐藥性分子機(jī)理顯得尤為重要。瘧原蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)的DHFR-TS 中2～3個(gè)位點(diǎn)的突變導(dǎo)致乙胺嘧啶抗性 (Wuetal., 1996)，因而可以用來(lái)篩選轉(zhuǎn)基因蟲(chóng)系。同樣的，研究者發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)的DHFR-TS誘發(fā)2個(gè)點(diǎn)突變后的耐藥基因同樣適用于艾美耳球蟲(chóng) (Clarketal., 2008)?；跍y(cè)序篩選出的耐藥基因借助轉(zhuǎn)染技術(shù)、利用基因突變、敲除等策略進(jìn)行驗(yàn)證，從而揭示耐藥分子機(jī)理及篩選新的藥物靶點(diǎn)。此外，頂復(fù)門原蟲(chóng)代謝途徑與宿主相比差別較大，可選取調(diào)控代謝等的基因或分子作為新的藥物靶點(diǎn)候選分子。因此轉(zhuǎn)基因技術(shù)將成為揭示耐藥性分子機(jī)理及篩選新的藥物靶點(diǎn)的有效手段。

3 總結(jié)與展望

艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因平臺(tái)經(jīng)歷十多年的探索式發(fā)展，為新型球蟲(chóng)病疫苗研發(fā)描繪了光明前景。同時(shí)，艾美耳球蟲(chóng)基因組計(jì)劃的不斷深入研究，極大地推動(dòng)了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在艾美耳球蟲(chóng)的應(yīng)用。此外，大量未知基因的功能研究及藥物靶基因和保護(hù)性抗原基因的篩選為轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供了更為廣闊的應(yīng)用平臺(tái)。然而艾美耳球蟲(chóng)的轉(zhuǎn)染效率及外源蛋白的表達(dá)量成為制約其遺傳操作的瓶頸。如何提高轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)表達(dá)外源蛋白的量也是我們亟待解決的問(wèn)題?；贑RISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)在球蟲(chóng)的探索研究將有望將轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)的發(fā)展推向新的高度。雞球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染技術(shù)作為強(qiáng)大的研究工具，將有效推動(dòng)轉(zhuǎn)基因球蟲(chóng)作為疫苗活載體的研究。