胡丹丹 索 勛 劉賢勇

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院國家動(dòng)物原蟲實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

我國是養(yǎng)禽大國，雞球蟲病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了大量直接或間接的經(jīng)濟(jì)損失。雞球蟲病主要由7種寄生于雞腸道上皮細(xì)胞的頂復(fù)門艾美耳屬球蟲導(dǎo)致，其中包括柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、布氏艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲以及和緩艾美耳球蟲。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，特別是高通量測序技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，以柔嫩艾美耳球蟲為代表的多種艾美耳球蟲得到廣泛的研究。我國科研工作者在雞球蟲的分子生物學(xué)上開展了諸多深入細(xì)致的工作，在球蟲研究領(lǐng)域做出了重要貢獻(xiàn)。例如，國內(nèi)學(xué)者解析了許多重要基因的表達(dá)定位情況及其生物學(xué)功能、完成了7種雞球蟲線粒體全基因組測序、建立并發(fā)展了球蟲轉(zhuǎn)基因和遺傳操作技術(shù)以及利用多種組學(xué)技術(shù)解析球蟲發(fā)育調(diào)控和耐藥性等科學(xué)問題。本文對(duì)這些工作進(jìn)行梳理綜述，為將來更好的開展研究工作服務(wù)。

1 雞球蟲功能基因研究

球蟲寄生和發(fā)育過程較為復(fù)雜，包含宿主體內(nèi)寄生狀態(tài)下的無性生殖(即裂殖生殖)、配子生殖、以及體外的孢子生殖(索勛等, 1998)。期間不同的球蟲基因在不同時(shí)間和空間上發(fā)揮各自的功能，使得球蟲發(fā)育正常進(jìn)行。研究人員致力于解析其中的重要基因，試圖通過不同的方式對(duì)這些基因進(jìn)行干預(yù)，以期阻斷球蟲的發(fā)育，達(dá)到控制球蟲病的目的。目前主要研究的干預(yù)靶標(biāo)是酶類和與子孢子入侵相關(guān)的蛋白(表1)。

代謝相關(guān)酶類，如脂磷酸酯磷酸酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶和多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶等大多在蟲體全時(shí)期均表達(dá)(Dongetal., 2014b; Guoetal., 2015; 劉曉麗等, 2017; Chenetal., 2018)，且在入侵或寄生階段高表達(dá)，說明它們?cè)谇蛳x能量代謝和蟲體寄生生活中起到重要的作用。相反，組蛋白修飾相關(guān)酶類，如組蛋白去乙?；? A(左云云等, 2016)和組蛋白去乙酰化酶3(劉兵, 2014)在未孢子化卵囊階段或孢子化過程中表達(dá)量最高，在其他階段反而很少表達(dá)。在球蟲孢子化過程中，球蟲未孢子化卵囊細(xì)胞核首先經(jīng)歷一次減數(shù)分裂，隨后進(jìn)行連續(xù)兩次有絲分裂最終發(fā)育成為含有8個(gè)子孢子的孢子化卵囊(Canningetal., 2010)，借此推測相關(guān)的組蛋白修飾主要是發(fā)生在球蟲細(xì)胞核的第1次減數(shù)分裂時(shí)期。

研究人員通過酶的特異性抑制劑或者針對(duì)蛋白的特異性抗體對(duì)球蟲子孢子進(jìn)行體外處理，然后觀察特異性拮抗相關(guān)蛋白，是否會(huì)對(duì)球蟲子孢子入侵細(xì)胞產(chǎn)生影響。其中，對(duì)EtCHP559(Zhaietal., 2016)、ZB10-E05(馬衛(wèi)嬌, 2011)、鈣依賴蛋白激酶(李洋, 2010)、胱硫醚 β合成酶和假定蛋白(李聰, 2016)的抑制作用最為顯著，子孢子在它們對(duì)應(yīng)的多克隆抗體或抗血清作用后，能降低其入侵細(xì)胞的效率約60%～70%；其次為Et440(崔曉霞, 2017)、蘋果酸脫氫酶(Chenetal., 2018)和鈣依賴蛋白激酶3(Hanetal., 2013)對(duì)它們用特異性抑制劑或多抗進(jìn)行抑制后，子孢子的入侵效率降低約30%～40%；對(duì)子孢子入侵細(xì)胞作用影響較小的蛋白為乳酸脫氫酶(Dongetal., 2014b)、艾美耳屬保守蛋白(Dongetal., 2014a)、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶樣蛋白(Hanetal., 2014)和微線蛋白2(崔曉霞, 2017)，特異性抑制這些蛋白，僅能抑制約10%～25%子孢子入侵。

在蛋白質(zhì)相互作用方面，以柔嫩艾美耳球蟲AMA1蛋白作為誘餌，從柔嫩艾美耳球蟲子孢子的酵母雙雜交文庫中篩選與AMA1互作的蛋白，并將對(duì)應(yīng)的序列重新進(jìn)行酵母雙雜交驗(yàn)證后，顯示EtMIC2等14個(gè)蛋白和AMA1互作(Hanetal., 2016)。利用GST pull-down技術(shù)找出了10個(gè)可能與AMA1相互作用的候選蛋白，其中也包含了EtMIC2蛋白；但隨后利用免疫共沉淀和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)，AMA1與EtMIC2蛋白之間并沒有相互作用(崔曉霞, 2017)。此外，采用相似的策略結(jié)合免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲菱形蛋白能夠與EtMIC4相互作用，并能對(duì)EtMIC4進(jìn)行切割(Zhengetal., 2011; Zhengetal., 2014)；利用柔嫩艾美耳球蟲端粒酶的RNA-binding結(jié)構(gòu)域作為誘餌，找到并用GST pull-down和Co-IP驗(yàn)證了Et-14-3-3蛋白能與之結(jié)合(Zhaoetal., 2014)。

球蟲重要基因功能的解析將極大地促進(jìn)我們對(duì)球蟲在感染、入侵以及整個(gè)寄生生活上的了解，有助于了解一些球蟲生物學(xué)過程和現(xiàn)象，如發(fā)育調(diào)控、有性到無性生殖的轉(zhuǎn)換以及早熟現(xiàn)象等；同時(shí)，抗原基因和耐藥性相關(guān)基因的研究也有助于開發(fā)新的球蟲病疫苗和藥物。

2 雞球蟲分子分類與檢測研究

2.1 線粒體基因組與系統(tǒng)發(fā)育

朱興全教授課題組(Linetal., 2011; Liuetal., 2012)對(duì)雞球蟲7個(gè)種的線粒體基因組進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)7個(gè)種的線粒體基因組結(jié)構(gòu)非常相似，線粒體基因組全長為6 148～6 407 bp，AT含量為64.53%～67.30%。雞球蟲線粒體基因組編碼3個(gè)蛋白質(zhì)基因(分別為cox1、cox3和cytb)、12個(gè)大亞基rRNA基因片段、7個(gè)小亞基rRNA基因片段，且無tRNA。編碼的3個(gè)基因種內(nèi)保守，種間差異稍大，可以明顯將7個(gè)種分為獨(dú)立分支(圖1)。其中，毒力最強(qiáng)的兩個(gè)物種，柔嫩艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲序列相似性較高，分類上也較為接近。

謝雯琴等(2010)對(duì)5株堆型艾美耳球蟲的cox3部分序列進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)序列完全一致。分別對(duì)6株巨型艾美耳球蟲和3株柔嫩艾美耳球蟲的cox1部分序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示同種不同株的cox1序列也完全一致(王鑫, 2007; 周飛亞等, 2014)。Cytb基因的同源性也相當(dāng)高，20株柔嫩艾美耳球蟲cytb基因序列一致性可達(dá)到99.9%(Lietal., 2017)。因此，球蟲線粒體基因組基因編碼序列一般不用作球蟲種內(nèi)鑒定。

2.2 雞球蟲PCR分類檢測方法研究

除傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察外，可用于球蟲鑒定的分子生物學(xué)方法包括同工酶技術(shù)、熒光定量PCR、RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)、和常規(guī)PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù) (李文超等, 2006a; 李文超等, 2006b)。目前，以RAPD和PCR技術(shù)使用較為廣泛。

圖1 基于線粒體蛋白編碼基因的7種雞球蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ樹)Fig.1 Phylogenetic (neighbor-joining) tree of 7 chicken coccidia based on mitochondrial protein coding genes利用MEGA軟件的鄰接法將整合的各蟲種的cox1、cox3和cytb序列進(jìn)行比對(duì)和作圖。E. acervulina、E. praecox、 E. brunetti、E. necatrix、E. tenella、E. mitis、 E. maxima、Plasmodium falciparum和P. knowlesi線粒體序列的NCBI登錄號(hào)分別為HQ702479、 HQ702483、 HQ702480、HQ702482、 HQ702484、 KF501573、HQ702481、 M76611和AB444108。The NJ-tree was constructed by Neighbor-Joining method in MEGA software with cox1, cox3 and cytb protein coding genes in their mitochondria. NCBI accession numbers for E. acervulina, E. praecox, E. brunetti, E. necatrix, E. tenella, E. mitis, E. maxima, Plasmodium falciparum and P. knowlesi are HQ702479, HQ702483, HQ702480, HQ702482, HQ702484, KF501573, HQ702481, M76611 and AB444108, respectively.

RAPD技術(shù)利用大量隨機(jī)引物對(duì)全基因組中差異位點(diǎn)進(jìn)行鑒別，技術(shù)簡單，無需同位素或DNA探針，靈敏度高，并且能夠體現(xiàn)全基因組范圍內(nèi)的差異。劉群等利用RAPD技術(shù)對(duì)柔嫩艾美耳球蟲早熟株、雞胚適應(yīng)株、親本毒株和田間分離的抗藥株進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)各分離株間均能找出差異條帶，建議將RAPD技術(shù)用于艾美耳球蟲株間差異的檢測(劉群等, 1998)。隨后，將該技術(shù)用于不同種和株雞球蟲間DNA多態(tài)性的比較，發(fā)現(xiàn)多數(shù)引物能使不同種球蟲產(chǎn)生完全不同的譜帶，證明RAPD技術(shù)可以用于雞球蟲蟲種的分類鑒定(劉群等, 2000)。對(duì)柔嫩艾美耳球蟲6個(gè)蟲株進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，得出這6個(gè)蟲株之間的相似值約在0.61～0.88之間，而不同種間的相似值則相對(duì)較低(陳兆國等, 2001)。對(duì)11株巨型艾美耳球蟲和兩株柔嫩艾美耳球蟲進(jìn)行分析，分別得出其種內(nèi)的相似值為0.7822和0.9216(陶建平, 2004)。對(duì)6種雞艾美耳球蟲和7個(gè)柔嫩艾美耳球蟲蟲株進(jìn)行的分析發(fā)現(xiàn)，60條隨機(jī)引物中有35條對(duì)6個(gè)種球蟲能夠擴(kuò)增出103條多態(tài)性條帶，不同種之間的相似性為0.253～0.575；在柔嫩艾美耳球蟲7個(gè)株中，60條隨機(jī)引物有28條共可以擴(kuò)增出41條多態(tài)性條帶，不同株之間相似性為0.391～0.696，明顯高于不同種之間的相似性(夏延富, 2009)。對(duì)安徽及周邊地區(qū)的柔嫩艾美耳球蟲進(jìn)行RAPD擴(kuò)增和相似性分析，顯示株間相似性為0.40～0.78(黃月月等, 2016)。

雖然RAPD在球蟲種內(nèi)和種間鑒定都取得了不錯(cuò)的成效，但是由于RAPD技術(shù)存在重復(fù)性較差的缺點(diǎn)，導(dǎo)致其在實(shí)際應(yīng)用上存在一定的局限性。相對(duì)來說操作更簡單，重復(fù)性更好的基于PCR技術(shù)的序列分析可以很好的對(duì)不同種的球蟲進(jìn)行鑒定。目前用于蟲種和蟲株P(guān)CR鑒定的序列有很多，包括頂質(zhì)體DNA、線粒體DNA、核DNA以及核糖體DNA。由于頂質(zhì)體DNA(謝雯琴, 2010; 劉國昌等, 2013)和線粒體DNA(王鑫, 2007; 謝雯琴等, 2010; 周飛亞等, 2014; Lietal., 2017)自身保守性較高，較少用于球蟲蟲種和蟲株的鑒定研究。核糖體DNA序列突變頻率相對(duì)較高、適用于物種間基因相似性較高的球蟲蟲種區(qū)別鑒定，因此被廣泛使用。蔡蘭對(duì)不同蟲種和蟲株的18S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)8種雞球蟲(含變位艾美耳球蟲)種間同源性為92.9%～99.4%；5株巨型艾美耳球蟲種內(nèi)同源性為96.9%～99.8%；7株柔嫩艾美耳球蟲種內(nèi)同源性為99.0%～99.9%(蔡蘭, 2006)。類似地，發(fā)現(xiàn)巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲種間18S rDNA同源性為96.5%～98.1%，而巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲種內(nèi)同源性分別為98.7%～99.3%和99.7%～99.9%(王鑫等, 2009)。有學(xué)者針對(duì)巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲的ITS-1序列設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，并建立了單一PCR和多重PCR檢測方法，其結(jié)果顯示兩種方法均能夠分別擴(kuò)增出各自特異性的條帶，且最小檢出濃度為0.5 ng(辛玲, 2005)。隨后，對(duì)10株巨型艾美耳球蟲ITS-1基因序列進(jìn)行比較分析，顯示同源性差異較大，為65.4%～100%(辛玲, 2005)。而最近研究檢出21株柔嫩艾美耳球蟲ITS-1序列同源性為92.5%～100%(Lietal., 2017)。同時(shí)，ITS-1序列在球蟲種間的保守性較低，只有34%～52%(夏延富等, 2009a)。這些結(jié)果說明，核糖體DNA中ITS-1序列比18S序列的變異頻率更豐富，更適合設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)球蟲進(jìn)行種間鑒定。

國外研究人員將RAPD技術(shù)和PCR鑒定方法進(jìn)行整合優(yōu)化，先用RAPD篩選出能夠區(qū)分不同蟲種和蟲株的特異性RAPD引物，并把特異性條帶轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記(如SCAR marker)，再以特異性PCR引物對(duì)蟲株進(jìn)行鑒定(Fernandezetal., 2003; Fernandezetal., 2004)。王鑫等(2010)根據(jù)我國流行的巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、堆形艾美耳球蟲的RAPD和SCAR分子標(biāo)記，針對(duì)ITS-I區(qū)序列分別設(shè)計(jì)了6對(duì)特異性引物，成功對(duì)這些蟲種進(jìn)行了鑒別，開發(fā)出適合于國內(nèi)使用的檢測標(biāo)記物。此外，國外已有一些較為成熟的基于ITS-1序列的特異性PCR檢測方法，如針對(duì)ITS-1設(shè)計(jì)特異的9對(duì)引物來鑒定雞球蟲7個(gè)種 (Lewetal., 2003)。此外，研究人員還對(duì)卵囊DNA提取方法和PCR引物進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，提出使用“卵囊研磨—GeneReleaser提取DNA—單種PCR”的流程，使得檢測更加靈敏，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠，也能節(jié)省大量的實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間(Haugetal., 2007)。

3 球蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)及應(yīng)用

3.1 雞球蟲轉(zhuǎn)染技術(shù)的建立與發(fā)展

1998年Kelleher和Tomley利用β-半乳糖苷酶作為報(bào)告基因，成功對(duì)柔嫩艾美耳球蟲進(jìn)行了體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(Kelleheretal., 1998)。此后，索勛教授實(shí)驗(yàn)室以紅、黃熒光蛋白作為報(bào)告基因，實(shí)現(xiàn)了球蟲的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(Haoetal., 2007)，并對(duì)體外培養(yǎng)的各時(shí)期球蟲進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光觀察(Shietal., 2008)。隨后，對(duì)球蟲體外轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率明顯高于環(huán)型質(zhì)粒，并且在轉(zhuǎn)染時(shí)加入限制性內(nèi)切酶可以進(jìn)一步提升轉(zhuǎn)染效率(Liuetal., 2008)。借助藥物篩選策略，使得球蟲篩選效率得到提升(Clarketal., 2008)，使球蟲轉(zhuǎn)染進(jìn)入了體內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 (Shietal., 2009; Yanetal., 2009)。研究者籍此可以得到大量穩(wěn)定表達(dá)特定蛋白的轉(zhuǎn)基因球蟲，便于后續(xù)球蟲生物學(xué)、免疫學(xué)等研究。

進(jìn)一步的研究還證實(shí)剛地弓形蟲和柔嫩艾美耳球蟲基因啟動(dòng)子序列能夠在兩個(gè)物種中互換和發(fā)揮功能(Zouetal., 2009)；同時(shí)，弓形蟲蛋白也可以在球蟲中實(shí)現(xiàn)表達(dá)(Yinetal., 2013)。國內(nèi)學(xué)者首次實(shí)現(xiàn)了雙框載體在球蟲中的穩(wěn)定表達(dá)，并且可以利用弓形蟲GRA8的信號(hào)肽序列，將報(bào)告基因打靶到納蟲空泡中(Yinetal., 2011)。這些結(jié)果說明弓形蟲和球蟲在基因表達(dá)調(diào)控上具有一定的保守性。由于雙框載體序列需要兩套上下游調(diào)控序列，增加了載體構(gòu)建的難度。為此利用了具有自剪切功能的2 A肽段，該肽段能夠在蛋白質(zhì)翻譯階段將串聯(lián)前后兩個(gè)基因的多肽鏈切開，變?yōu)閮蓚€(gè)獨(dú)立的蛋白，從而縮短了載體長度(Tangetal., 2016a)。為提升外源蛋白在球蟲中的表達(dá)量，對(duì)轉(zhuǎn)染載體進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果顯示，將原先常用的Histone 4、Actin和Tubulin等啟動(dòng)子替換為SAG13啟動(dòng)子，從而進(jìn)一步提升表達(dá)水平(Tangetal., 2016a)。此外，和緩艾美耳球蟲(Meietal., 2014)、堆型艾美耳球蟲(張思新等, 2015)和毒害艾美耳球蟲(Duanetal., 2016)均先后實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的蟲株。

3.2 雞球蟲表達(dá)外源蛋白作為新型疫苗載體

自國內(nèi)學(xué)者首次提出利用表達(dá)外源抗原的轉(zhuǎn)基因球蟲卵囊作為新型活疫苗載體這一設(shè)想以來，先后在此方向上取得一系列成績。將模式抗原黃色熒光蛋白分別表達(dá)于柔嫩艾美耳球蟲的胞漿和微線體中，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因蟲株均能刺激雞淋巴細(xì)胞特異性增殖并產(chǎn)生IFN-γ分泌；其中，將黃色熒光蛋白表達(dá)于微線體上的蟲株能夠激發(fā)更強(qiáng)烈的抗原特異性的淋巴細(xì)胞增殖和更高的IgA水平(Huangetal., 2011)。在柔嫩艾美耳球蟲中成功表達(dá)H5N1禽流感病毒M2蛋白外膜區(qū)(M2 ectodomain，M2e)抗原且能夠被特異性抗體所識(shí)別(Liuetal., 2013; 李秋明等, 2013)。在柔嫩艾美耳球蟲中轉(zhuǎn)入弓形蟲SAG1基因，該基因表達(dá)于球蟲子孢子表面，并且能夠被雞免疫系統(tǒng)識(shí)別，對(duì)弓形蟲產(chǎn)生部分免疫保護(hù)效果；同時(shí)，將表達(dá)弓形蟲SAG1的球蟲子孢子對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔免疫后，使小鼠產(chǎn)生特異性的Th1型免疫反應(yīng)，并能延長攻毒小鼠死亡時(shí)間(Tangetal., 2016b)。同樣地，在柔嫩艾美耳球蟲中過表達(dá)巨型艾美耳球蟲免疫優(yōu)勢抗原IMP1(immune mapped protein 1)也能被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，免疫該轉(zhuǎn)基因球蟲能夠激發(fā)雞體同時(shí)產(chǎn)生對(duì)柔嫩和巨型艾美耳球蟲的保護(hù)力(Tangetal., 2017)。與此同時(shí)，為進(jìn)一步提升球蟲自身的免疫效果，使球蟲表達(dá)一些免疫佐劑分子，比如在和緩艾美耳球蟲中轉(zhuǎn)入IL-2或IgY的 Fc片段，均能夠比正常野生蟲株提供更多的卵囊減少量(Lietal., 2015; Qinetal., 2016)。在柔嫩艾美耳球蟲中轉(zhuǎn)入巨型艾美耳球蟲profilin基因(Toll樣受體的配體)，能夠增強(qiáng)柔嫩艾美耳球蟲特異性免疫，并能提供更好的免疫保護(hù)效果(Tangetal., 2018)。

4 雞球蟲組學(xué)研究

4.1 雞球蟲參考基因組

近來多個(gè)研究小組聯(lián)合對(duì)雞球蟲的7個(gè)蟲種進(jìn)行了全基因組測序，其中重點(diǎn)對(duì)柔嫩艾美耳球蟲Houghton株進(jìn)行了拼接和注釋，使得雞球蟲研究進(jìn)入后基因組時(shí)代(Reidetal., 2014)。但是由于其在建庫時(shí)僅采用一個(gè)300 bp的小片段文庫進(jìn)行測序(柔嫩艾美耳球蟲多一個(gè)3 kb文庫)，以及球蟲基因組本身重復(fù)序列較多，導(dǎo)致基因組非常碎片化(scaffold N50最高為201 kb)，不能夠滿足當(dāng)前研究的需求。為此，本課題組對(duì)柔嫩艾美耳球蟲基因組進(jìn)行重新測序和拼接注釋，利用PacBio三代測序和高通量染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)(Hi-C)將99%以上的序列掛載到14條染色體上，極大的提升了基因組的完整性(胡丹丹等，未發(fā)表數(shù)據(jù))。同時(shí)還對(duì)柔嫩艾美耳球蟲基因組的重復(fù)序列進(jìn)行了重新分析，并對(duì)基因組進(jìn)行了基因重注釋(胡丹丹等，未發(fā)表數(shù)據(jù))。新版基因組將極大促進(jìn)球蟲分子生物學(xué)發(fā)展及其重要性狀分子機(jī)制的解析。

4.2 組學(xué)在球蟲發(fā)育調(diào)控上的研究

雞球蟲生活史較為復(fù)雜，各個(gè)發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)均有較大差異。利用抑制性消減文庫對(duì)柔嫩艾美耳球蟲孢子化過程中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了研究，從兩個(gè)子孢子cDNA消減文庫中能夠獲得40個(gè)單一有效序列，其中包括MASP、MIC、SAG等細(xì)胞器蛋白或表面抗原等(韓紅玉等, 2007)。利用轉(zhuǎn)錄組高通量測序，分別比較毒害艾美耳球蟲第2代和第3代裂殖子的差異表達(dá)基因以及第3代裂殖子與配子體的差異基因，找出837個(gè)基因在第3代裂殖子中高表達(dá)，1 216個(gè)基因低表達(dá)；分別有95和48個(gè)基因是2代和3代裂殖子特異性表達(dá)基因(Suetal., 2017, 2018)。在第2代裂殖子中顯著富集的上調(diào)表達(dá)基因主要與蛋白質(zhì)降解和氨基酸代謝相關(guān)，在第3代裂殖子中則主要是與轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的基因(Suetal., 2017)。第3代裂殖子同配子體的差異基因相對(duì)更多，達(dá)到4 267個(gè)，從中篩選出了53與卵囊壁形成相關(guān)的基因以及30個(gè)與小配子發(fā)育相關(guān)的基因。這些數(shù)據(jù)為更好的了解球蟲生活史提供了參考(Suetal., 2018)。

早熟弱毒系是將原始野生毒株進(jìn)行不斷選育后得到的生活史發(fā)生了極大改變的蟲株，其最大的特征是裂殖生殖代次缺失或內(nèi)生性發(fā)育速度加快(Jeffers, 1975)。目前調(diào)控早熟系產(chǎn)生的機(jī)制尚不明確。李玉劍(2009)分別構(gòu)建了堆型艾美耳球蟲早熟株和原始株的抑制性消減cDNA文庫。從早熟株消減文庫中獲得20個(gè)單一有效序列，包括絲氨酸蛋白酶抑制劑、表面抗原和一些假定蛋白；從野生蟲株消減文庫中獲得21個(gè)單一有效序列，包括ATP合成酶、線粒體醛脫氫酶前提以及假定蛋白等。利用抑制性消減cDNA文庫結(jié)合芯片分析的方法對(duì)巨型艾美耳球蟲早熟差異基因進(jìn)行了篩選，找出其孢子化卵囊階段32個(gè)單一有效序列，其中21個(gè)在早熟系中下調(diào)表達(dá)，11個(gè)上調(diào)表達(dá)(Dongetal., 2011)。其中包括菱形蛋白、轉(zhuǎn)氫酶、serpin和陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶等。這些研究為研究調(diào)控球蟲早熟性狀打下了基礎(chǔ)，但是抑制消減cDNA文庫的通量和靈敏度較低，需要采用通量更大的方法找出更多差異基因，以便提供更多有效信息。如國外研究人員利用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)θ崮墼缡旌鸵吧x株的孢子化卵囊進(jìn)行測序分析(Matsubayashietal., 2016)，但由于其測序樣品沒有生物學(xué)重復(fù)，其數(shù)據(jù)僅供參考。

4.3 組學(xué)在球蟲耐藥性上的研究

球蟲耐藥性廣泛存在，影響了球蟲病的防控效果。研究人員希望通過找到耐藥蟲株與敏感蟲株之間差異表達(dá)的蛋白來研究耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制(夏延富等, 2009b)。采用消減文庫的方法篩選柔嫩艾美耳球蟲抗馬杜拉霉素和地克珠利相關(guān)基因，分別得到4個(gè)和3個(gè)基因可能與之相關(guān)(韓紅玉等, 2005)。通過cDNA陣列分析的方法分別比較莫能菌素和馬杜霉素耐藥蟲株與敏感株的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)莫能菌素耐藥蟲株中大量基因上調(diào)表達(dá)，并且這些基因大多參與細(xì)胞骨架重排和能量代謝途徑；而在馬杜霉素耐藥蟲株中高表達(dá)的基因大多為細(xì)胞骨架基因以及參與蟲體入侵的基因；此外，在馬杜霉素耐藥蟲株中，與糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因卻下調(diào)表達(dá)(Chenetal., 2008)。直接對(duì)柔嫩艾美耳球蟲經(jīng)地克珠利處理后的蛋白質(zhì)表達(dá)變化進(jìn)行分析(Shenetal., 2014)，能夠得到13個(gè)在處理后表達(dá)量顯著變化的蛋白，這些差異蛋白參與代謝、蛋白合成和蟲體入侵等過程。隨著測序技術(shù)的發(fā)展及成本的降低，可利用高通量測序技術(shù)發(fā)掘耐藥性蟲株和敏感蟲株基因組上的標(biāo)記。通過對(duì)兩株地克珠利完全耐藥株和兩株敏感株的裂殖子階段轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)330 個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因在DNA 整合、金屬離子結(jié)合和陽離子結(jié)合功能中得到了明顯富集，可能與地克珠利耐藥性相關(guān)，但是還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(韓貞艷,2018)。

4.4 雞球蟲病毒基因組

許多寄生原蟲被雙鏈RNA病毒感染，如毛滴蟲、賈第蟲和利士曼原蟲等。在柔嫩艾美耳球蟲中發(fā)現(xiàn)了一株雙鏈RNA病毒(直徑約為30 nm)并對(duì)其全長基因組進(jìn)行測序(Wuetal., 2016)。結(jié)果顯示，該雙鏈RNA病毒基因組全長6 006 bp，僅含有兩個(gè)編碼框，分別長2 367 bp和3 216 bp，其中有5個(gè)堿基重疊。這兩個(gè)編碼框分別編碼約85 kDa的衣殼蛋白和118.2 kDa的RNA依賴性RNA聚合酶。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，該RNA依賴性RNA聚合酶可以與球蟲卵巢腫瘤蛋白樣半胱氨酸蛋白酶相互作用(Wangetal., 2018)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該病毒與布氏艾美耳球蟲體內(nèi)的病毒同源(29%～36%)。該病毒基因組序列特征類似于Totiviridae病毒，但系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)卻與Victorivirus病毒聚類，提示該病毒可能屬于一個(gè)自己特定的分支。

5 展望

我國對(duì)球蟲分子生物學(xué)的研究已逐步靠近國際水平并在某些領(lǐng)域開始取得領(lǐng)先。然而，相比于其他頂復(fù)門的原蟲(如弓形蟲和瘧原蟲等)，球蟲的整體研究水平還相對(duì)較低。究其原因，制約球蟲分子生物學(xué)發(fā)展的主要原因有兩個(gè)：第一是沒有可靠的體外培養(yǎng)體系用于球蟲的培養(yǎng)。目前球蟲的傳代主要依賴雞體內(nèi)傳代，傳代周期長、收取和純化卵囊過程繁瑣，易交叉污染。同為頂復(fù)門原蟲的弓形蟲和瘧原蟲均可以在體外細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定傳代。體外培養(yǎng)體系的成熟有利于實(shí)驗(yàn)操作，也有利于對(duì)蟲體的不同處理(如藥物、抑制劑等)和實(shí)時(shí)觀察。如果能實(shí)現(xiàn)這一步的突破，將會(huì)極大加速球蟲研究進(jìn)程。研究顯示柔嫩艾美耳球蟲可以在雞腎原代細(xì)胞中完成生活史(Shietal., 2008)，但遺憾的是由于其卵囊產(chǎn)量極低，還不能作為穩(wěn)定的球蟲體外傳代系統(tǒng)。而最新的研究表明，柔嫩艾美耳球蟲也可以在CLEC-213等細(xì)胞系中發(fā)育成為配子體 (Bussièreetal., 2018)，但未能檢測到卵囊產(chǎn)生。這些研究說明了球蟲體外培養(yǎng)系統(tǒng)理論上是可行的，但是還需要投入大量的研究工作。第二是球蟲缺乏基因組編輯工具。本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)柔嫩艾美耳球蟲開發(fā)了一套基于穩(wěn)定表達(dá)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的球蟲基因敲除工具蟲株，現(xiàn)已成功實(shí)現(xiàn)球蟲基因敲除(胡丹丹等，未發(fā)表數(shù)據(jù))，希望該系統(tǒng)在將來能為球蟲功能基因研究提供幫助。另一方面，隨著基因編輯在球蟲中的應(yīng)用，一些問題也迎面而來。目前在球蟲中使用的篩選標(biāo)記主要有黃色(或綠色)熒光蛋白、紅色熒光蛋白以及弓形蟲耐藥基因DHFR-TS，這些篩選標(biāo)記現(xiàn)已不能完全滿足球蟲研究，特別是多基因敲除等類似的研究。所以，及早解析球蟲耐藥性機(jī)制，找出一系列耐藥基因，也可同時(shí)服務(wù)于球蟲分子生物學(xué)研究。