于鵬洋，李璐，趙聰，鄭義，朱蕾，劉萍，韓東衛(wèi),葛鵬玲*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000； 3.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011； 4.中國(guó)人民解放軍軍事經(jīng)濟(jì)學(xué)院門診部，湖北 武漢 430000)

中藥復(fù)方口服后其真正發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)既可能是原型藥物，也可能是代謝產(chǎn)物[1]。方劑組方復(fù)雜，成分繁多，干擾因素較多，選取UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)應(yīng)用于不同生物樣品中微量成分和代謝產(chǎn)物的鑒定，具有分析時(shí)間短，檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。聯(lián)合Metabolynx軟件通過(guò)比對(duì)空白樣品與含藥樣品，分析去除干擾離子來(lái)簡(jiǎn)化質(zhì)譜圖的解析，從而在復(fù)雜生物基質(zhì)中快速檢測(cè)出藥物代謝產(chǎn)物，為闡明其作用機(jī)制及臨床合理用藥提供參考[2-3]。

花旗澤仁是臨床上治療2型糖尿病的經(jīng)驗(yàn)方，本課題組前期工作已完成其主要藥效學(xué)研究，為進(jìn)一步完善花旗澤仁成藥的評(píng)價(jià)，本文選擇花旗澤仁主要活性成分人參皂苷Rb1、澤瀉醇A-24-醋酸酯及9-HODE作為研究對(duì)象，采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)分析完成花旗澤仁3種活性成分及其代謝產(chǎn)物通過(guò)尿液和糞便的排泄情況。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠6只，雄性，3月齡，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黑)2013-004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，明暗周期12 h，房間溫度在(20±2)℃，相對(duì)濕度50%左右，通風(fēng)良好，勤換墊料，自由攝食和飲水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 花旗澤仁標(biāo)準(zhǔn)混合液的制備

取花旗澤仁水煎液100 μL，置1.5 mL離心管中，12 000 rpm高速離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜后經(jīng)HPLC-MS/MS測(cè)定。結(jié)果表明,花旗澤仁提取物中主要活性成分的百分比如下：人參皂苷0.16%、澤瀉醇A-24-醋酸酯0.004 5%、9-HODE 0.013%?；ㄆ鞚扇蕵?biāo)準(zhǔn)混合液按照主要活性成分百分比進(jìn)行配置。精密稱取適量人參皂苷Rb1、澤瀉醇A-24-醋酸酯及9-HODE各標(biāo)準(zhǔn)品適量，配置如下濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合藥液：人參皂苷Rb1為96 mg/mL，澤瀉醇A-24-醋酸酯2.7 mg/mL，9-HODE為7.8 mg/mL。4℃保存，使用前水浴加溫至37℃。

2.2 儲(chǔ)備液的配制

精密稱取地西泮適量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得濃度為200 μg/mL的儲(chǔ)備液；分別精密稱取人參皂苷Rb1、澤瀉醇A-24-醋酸酯與9-HODE適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得濃度分別為400 μg/mL、40 μg/mL、400 μg/mL的儲(chǔ)備液。所有儲(chǔ)備液置于-20℃冰箱保存。

2.3 工作溶液的配制

精密移取人參皂苷Rb1和澤瀉醇A-24-醋酸酯儲(chǔ)備液適量，以甲醇配成濃度如下的混合工作溶液：人參皂苷Rb1：1、2、4、10、20、40、100、200 μg/mL；澤瀉醇A-24-醋酸酯：0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1、2、4 μg/mL；精密移取9-HODE儲(chǔ)備液適量，以甲醇配成濃度為0.2、1、2、10、20、100、200、400 μg/mL一系列工作溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線尿液、糞便樣品和質(zhì)控(quality control,QC)樣品的配制

上述濃度的系列混合工作溶液，用空白生物樣品(尿液、糞便甲醇溶液)進(jìn)行1:10稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，濃度范圍如下：人參皂苷Rb1為0.1～20 μg/mL；澤瀉醇A-24-醋酸酯為0.002～0.4 μg/mL；9-HODE為0.02～40 μg/mL。

QC樣品同法稀釋配制，濃度如下：人參皂苷Rb1為 0.2、2、16 μg/mL；澤瀉醇A-24-醋酸酯為0.004、0.04、0.32 μg/mL；9-HODE為0.1、2、32 μg/mL。

2.5 色譜檢測(cè)條件

色譜柱為C18柱(1.8 μm，100 mm×2.1 mm，Agilent Technologies，美國(guó))，流速0.3 ml/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積10 μL;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4℃。流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為水(含0.1%甲酸)。

人參皂苷Rb1與澤瀉醇A-24-醋酸酯洗脫方式為梯度洗脫，每個(gè)樣品的分析周期為12 min。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相洗脫程序

9-HODE洗脫方法采用A:B為80:20的等度洗脫條件，流速為 0.3 mL/min；樣品的分析周期為4 min。

2.6 質(zhì)譜檢測(cè)條件

采用ESI-離子源，霧化氣與干燥氣均為氮?dú)?；碰撞氣為高純氮?dú)?，各檢測(cè)成分的質(zhì)譜參數(shù)見表2；其他質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化后如下：離子源電壓3 500 V、霧化器流速10 L/min、霧化器溫度350 ℃、干燥氣溫度350 ℃、干燥氣流速10 L/min、掃描頻率2 amu/s、掃描范圍100～1 300 amu、霧化器壓力50 V、毛細(xì)管電壓3 500 V。

表2 待測(cè)成分和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

注：Ginsenoside Rb1：人參皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯；9-HODE：9-羥基(10E,12E)十八碳二烯酸；Diazepam：地西泮

2.7 尿液及糞便樣品的采集

取SD大鼠6只，雄性，給藥前禁食12 h，自由飲水，灌胃給予花旗澤仁水煎液，劑量為花旗澤仁組1 mL/100 g體質(zhì)量。于給藥前及給藥后12 h采集尿液、糞便樣本，收集到的尿液6 000 rpm離心10 min，取上清液-80℃保存；收集到的糞便陰干后置于-80℃保存。

2.8 尿液、糞便樣品預(yù)處理方法

取尿液100 μL，加入同體積的地西泮內(nèi)標(biāo)溶液(1 μg/mL)于12 000 rpm離心10 min，取上清液0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，進(jìn)樣體積為10 μL。

取碾碎混勻的糞便1 mg，加甲醇3 mL溶解, 超聲10 min，取上清液100 μL，加入同體積的地西泮內(nèi)標(biāo)溶液(1 μg/mL)，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，進(jìn)樣體積為10 μL。

2.9 Metabolynx處理

將待測(cè)化合物可能的I相、II相代謝產(chǎn)物輸入Metabolynx軟件中，質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢測(cè)誤差范圍設(shè)為<1×10-5，同時(shí)將質(zhì)量虧損過(guò)濾應(yīng)用于數(shù)據(jù)處理。采用兩次UPLC串聯(lián)Q-TOF/MS分析完成代謝產(chǎn)物的尋找與確認(rèn)。首先，對(duì)經(jīng)UPLC色譜分離的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，并運(yùn)用Metabolynx軟件尋找可能的代謝物。其次，采用與第一次相同的UPLC色譜條件，對(duì)已找尋到的可能代謝物進(jìn)行MS/MS分析，以進(jìn)一步確認(rèn)代謝產(chǎn)物。本文中所有MS離子碎片都是在選擇了產(chǎn)物分子離子峰后進(jìn)行MS/MS分析的結(jié)果。

2.10 方法學(xué)驗(yàn)證

2.10.1 選擇性

將6個(gè)不同個(gè)體的空白生物樣本及添加標(biāo)準(zhǔn)品的生物樣本(人參皂苷Rb1:1 μg/mL；澤瀉醇A-24-醋酸酯：0.2 μg/mL；9-HODE：0.02 μg/mL；地西泮：0.5 μg/mL)按照上述方法處理生物樣品后進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，比較不同空白生物樣本和添加標(biāo)準(zhǔn)品的生物樣本色譜圖。觀察待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)的出峰位置，空白生物樣本中的內(nèi)源性成分是否存在干擾。

2.10.2 線性范圍和定量下限(lower limit of quantification，LLOQ)

以峰面積的比值y(待測(cè)組分/內(nèi)標(biāo))為縱坐標(biāo)，濃度x為橫坐標(biāo)，采用1/x加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，進(jìn)行6條標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。LLOQ是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，其響應(yīng)值應(yīng)為空白生物基質(zhì)干擾物響應(yīng)值的5倍以上(S/N≥5)，且精密度表示為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)應(yīng)≤20%，準(zhǔn)確度表示為偏倚(bias)應(yīng)在±20%范圍內(nèi)。

2.10.3 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

配制添加待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)品的糞便樣品(低、中、高QC濃度)，按照樣品前處理操作后測(cè)定響應(yīng)值(峰面積3)；將6個(gè)不同批次來(lái)源的空白生物樣品待測(cè)組分測(cè)定響應(yīng)值(峰面積2)；用流動(dòng)相配制相應(yīng)濃度不含基質(zhì)的純樣品溶液測(cè)定響應(yīng)值(峰面積1)。絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算值為峰面積2與峰面積1的比值；提取回收率的計(jì)算值為峰面積3與峰面積2的比值。同時(shí)考察內(nèi)標(biāo)地西泮的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率。尿液樣本預(yù)處理方法不涉及提取過(guò)程，因此不考察提取回收率。

2.10.4 精密度和準(zhǔn)確度

采用3個(gè)不同分析日的數(shù)據(jù)對(duì)測(cè)定方法的精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行驗(yàn)證，低、中、高3個(gè)質(zhì)控(quality control,QC)濃度的標(biāo)準(zhǔn)生物樣品在每個(gè)分析日內(nèi)進(jìn)行6次測(cè)定，求算每個(gè)分析日的日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度，以及3批共18個(gè)數(shù)據(jù)的日間精密度和準(zhǔn)確度。并在樣品測(cè)定的不同批次中，加入QC樣品進(jìn)行方法學(xué)質(zhì)控。

2.10.5 樣品穩(wěn)定性

方法學(xué)驗(yàn)證過(guò)程中，對(duì)分析樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，包括3次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性，室溫下25℃放置4 h的短期穩(wěn)定性，-80℃冷凍條件下保存2周的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，以及樣品處理后置于自動(dòng)進(jìn)樣器(4℃)12 h的穩(wěn)定性，將低、中、高3個(gè)QC濃度的標(biāo)準(zhǔn)生物樣品在上述條件下保存后，分析測(cè)定得到的樣品濃度與新配制相應(yīng)濃度的QC樣品進(jìn)行比較，以相對(duì)偏差(RE)表示。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 選擇性

圖1～圖2顯示待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)的出峰位置，空白生物樣本中的內(nèi)源性成分對(duì)人參皂苷Rb1與澤瀉醇A-24-醋酸酯的測(cè)定不造成干擾。由于大鼠體內(nèi)含有一定量的9-HODE，因此如圖1A～圖2A所示空白尿液及糞便中出現(xiàn)9-HODE色譜峰。圖中顯示在上述分析條件下，人參皂苷Rb1、澤瀉醇A-24-醋酸酯、9-HODE和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間具體如下：人參皂苷Rb1為6.2 min，澤瀉醇A-24-醋酸酯為9.3 min，地西泮為1.8 min，9-HODE為2.5 min。

圖1 地西泮(1)、人參皂苷Rb1(2)、澤瀉醇A-24-醋酸酯(3)、9-HODE(4)的尿液樣品色譜圖注：空白尿液(A)；空白尿液標(biāo)準(zhǔn)添加的待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)(B)；給藥2 h后的實(shí)測(cè)尿液樣品(C)

圖2 地西泮(1)、人參皂苷Rb1(2)、澤瀉醇A-24-醋酸酯(3)、9-HODE(4)的糞便樣品色譜圖注：空白糞便(A)；空白糞便標(biāo)準(zhǔn)添加的待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)(B)；給藥2 h后的實(shí)測(cè)糞便樣品(C)

3.1.2 線性范圍與定量下限

2種生物樣本共6條標(biāo)準(zhǔn)曲線在考察的下列濃度范圍內(nèi)均顯示良好的線性關(guān)系，人參皂苷Rb1：0.05～10 μg/mL；澤瀉醇A-24-醋酸酯：0.001～0.2 μg/mL；9-HODE：0.01～20 μg/mL。待測(cè)組分的平均回歸方程見表3。

表3 待測(cè)組分在各樣品中的平均回歸方程和相關(guān)系數(shù)

注：Ginsenoside Rb1：人參皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯；9-HODE：9-羥基(10E,12E)十八碳二烯酸

用來(lái)源不同的空白樣品新配LLOQ濃度點(diǎn)樣品進(jìn)行定量下限的考察。結(jié)果顯示，信噪比(S/N)≥5，且精密度表示為RSD≤20%，準(zhǔn)確度表示為bias在±20%范圍內(nèi)。LLOQ點(diǎn)的準(zhǔn)確度和精密度均達(dá)到了要求，所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。而其他待測(cè)組分未見明顯的殘留效應(yīng)。

3.1.3 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

表4列出了糞便樣品低、中、高QC濃度的人參皂苷Rb1、澤瀉醇A-24-醋酸酯和地西泮內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率考察結(jié)果。絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)分別為77.4%～82.5%、81.5%～87.0%及87.4%，在基質(zhì)效應(yīng)的程度基本一致，不隨濃度發(fā)生變化，且RSD<20%，低、中、高QC濃度下不影響本分析方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。提取回收率均在80%以上，提取回收率良好，且精密度符合要求。人參皂苷Rb1、澤瀉醇A-24-醋酸酯和地西泮內(nèi)標(biāo)在尿液中的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表5。在低、中、高QC濃度下基質(zhì)效應(yīng)均大于80%，三個(gè)濃度下基質(zhì)效應(yīng)的程度基本一致，且RSD<20%，變異程度較低，符合生物樣品分析要求。表6中數(shù)據(jù)顯示糞便在前述處理?xiàng)l件下，低、中、高QC濃度下9-HODE的提取回收率分別為89.2%、92.1%、90.1%，總體而言，提取回收率良好。

表4 待測(cè)組分在大鼠糞便中的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率(n=6)

注：Ginsenoside Rb1：人參皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯；Diazepam：地西泮

表5 待測(cè)組分在大鼠尿液中的基質(zhì)效應(yīng)(n=6)

注：Ginsenoside Rb1：人參皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯；Diazepam：地西泮

表6 9-HODE在大鼠糞便中的提取回收率(n=6)

3.1.4 精密度和準(zhǔn)確度

如表7～8所示，2種生物樣品中3種有效成分的日內(nèi)與日間準(zhǔn)確度(bias)均在±20%之間；日內(nèi)與日間精密度(RSD)均小于20%，數(shù)據(jù)表明待測(cè)組分在大鼠尿液、糞便中的精密度和準(zhǔn)確度均符合生物樣品的分析要求。

表7 待測(cè)組分在大鼠尿液中的精密度和準(zhǔn)確度

注：Ginsenoside Rb1：人參皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯；9-HODE：9-羥基(10E,12E)十八碳二烯酸

表8 待測(cè)組分在大鼠糞便中的精密度和準(zhǔn)確度

注：Ginsenoside Rb1：人參皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯；9-HODE：9-羥基(10E,12E)十八碳二烯酸

3.1.5 樣品穩(wěn)定性

低、中、高三個(gè)QC濃度的標(biāo)準(zhǔn)尿液、糞便樣品的3次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性，室溫下25℃放置4 h的短期穩(wěn)定性，-80 ℃冷凍條件下保存2周的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，以及樣品處理后置于自動(dòng)機(jī)進(jìn)樣器(4 ℃)中12 h的穩(wěn)定性見表9～10。結(jié)果顯示相對(duì)偏差均在±20%，未發(fā)現(xiàn)明顯降解反應(yīng)，表明待測(cè)組分在大鼠尿液、糞便中的穩(wěn)定性符合生物樣品的分析要求。

表9 待測(cè)組分在大鼠尿液中的穩(wěn)定性

注：Ginsenoside Rb1：人參皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯；9-HODE：9-羥基(10E,12E)十八碳二烯酸

表10 待測(cè)組分在大鼠糞便中的穩(wěn)定性

注：Ginsenoside Rb1：人參皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯；9-HODE：9-羥基(10E,12E)十八碳二烯酸

3.2 花旗澤仁中3種有效成分在尿液、糞便中的濃度

大鼠分別灌胃花旗澤仁標(biāo)準(zhǔn)混合液后，取尿液、糞便樣品在上述檢測(cè)條件下檢測(cè)，3種有效成分均有響應(yīng)，測(cè)定數(shù)據(jù)見表11。

表11 待測(cè)組分在尿液、糞便中的濃度

3.3 代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠灌胃花旗澤仁3種有效成分(人參皂苷Rb1、澤瀉醇A-24-醋酸酯及9-HODE)混合藥液后，收集的尿液、糞便樣本，對(duì)其中存在的3種成分的代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，共發(fā)現(xiàn)與人參皂苷Rb1相關(guān)的代謝產(chǎn)物13個(gè)，主要碎片離子見表12。此外，鑒定出澤瀉醇A-24-醋酸酯及9-HODE的代謝產(chǎn)物各1個(gè)，主要碎片離子見表13和表14。

表12 人參皂苷Rb1相關(guān)的代謝產(chǎn)物主要碎片離子總表

表13 澤瀉醇A-24-醋酸酯代謝產(chǎn)物主要碎片離子

表14 9-HODE代謝產(chǎn)物主要碎片離子

Ginsenoside Rb1在尿液中主要以原型藥物為主，此外，還有少量Ginsenoside Rb1在體內(nèi)發(fā)生水解、結(jié)合、氧化和脫氫反應(yīng)，其中Ginsenoside Rd、Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rh2、Ginsenoside F2、Ginsenoside Cpd K、Gypenoside XVII、Gypenoside LXXV、Ginsenoside Ppd均為Ginsenoside Rb1的水解代謝產(chǎn)物，并隨著取血時(shí)間的推移，代謝產(chǎn)物種類逐漸增多。Monooxygenated Rb1為Ginsenoside Rb1的氧化代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步氧化生成Di-oxygenated Rb1，即：Ginsenoside Rb1的過(guò)氧化代謝產(chǎn)物。Dehydrogenated Rb1為Ginsenoside Rb1在體內(nèi)發(fā)生脫氫反應(yīng)所得。Ginsenoside Rb1與五碳糖結(jié)合生成Combined Rb1(1)，與葡萄糖結(jié)合則生成Combined Rb1(2)。主要代謝途徑見圖3。此外，還發(fā)現(xiàn)Alisol A 24-acetate及9-HODE代謝產(chǎn)物各一種，Alisol A為Alisol A 24-acetate的水解代謝產(chǎn)物，9-HODE在體內(nèi)發(fā)生氧化反應(yīng)生成9-oxoODE，Alisol A 24-acetate及9-HODE代謝途徑見圖4、圖5。

圖3 人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)代謝流程圖

圖4 澤瀉醇A-24-醋酸酯在大鼠體內(nèi)代謝流程圖

圖5 9-HODE在大鼠體內(nèi)代謝流程圖

糞便中共發(fā)現(xiàn)Ginsenoside Rb1代謝產(chǎn)物5種，分別是Ginsenoside Rd、Ginsenoside F2、Ginsenoside Cpd K及Ginsenoside Ppd，推測(cè)其為進(jìn)入體內(nèi)后由胃腸道菌群代謝產(chǎn)生。此外還發(fā)現(xiàn)Alisol A 24-acetate代謝產(chǎn)物Alisol A，未檢測(cè)到9-HODE代謝產(chǎn)物。

4 討論

本部分實(shí)驗(yàn)研究在前期藥代動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)上，建立了靈敏、有效的HPLC-MS/MS方法測(cè)定大鼠尿液、糞便中3種有效成分的濃度，并進(jìn)行方法學(xué)考察，選擇性、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率及穩(wěn)定性考察結(jié)果均符合樣品檢測(cè)要求[4]。結(jié)果表明,本方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好、可以用于大鼠尿液、糞便中3種有效成分及其代謝產(chǎn)物的濃度測(cè)定。

大鼠灌胃花旗澤仁標(biāo)準(zhǔn)混合液后，我們?cè)谀蛞?、糞便中均檢測(cè)到了人參皂苷Rb1及其相關(guān)代謝產(chǎn)物，其中有大量人參皂苷Rb1原型由糞便排出體外，這可能與人參皂苷Rb1的極性較大，脂溶性較差，不利于其在胃腸道吸收有關(guān)。

此外，還有少量人參皂苷Rb1在體內(nèi)發(fā)生水解、結(jié)合、氧化和脫氫反應(yīng)。腸道菌群可以把含量較高的G-Rb1代謝轉(zhuǎn)化為G-Rd，故G-Rd是皂苷代謝后被腸道吸收利用的重要形式之一[5]。研究表明,G-Rd具有廣泛的生物活性，有顯著的鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和抗輻射等方面的作用[6]，也有文獻(xiàn)報(bào)道人參二醇型皂苷G-Rd有一定的降血糖作用[7]3-4。C-K具有抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤、神經(jīng)損傷修復(fù)和保肝等作用，而且在神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)方面也具有良好的調(diào)節(jié)作用[8]。此外，有研究證實(shí)人參皂苷C-K具有明顯的降血糖作用[7]23-24。

我們?cè)谀蛞?、糞便中均檢測(cè)到了Alisol A 24-acetate及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定Alisol A 24-acetate的代謝產(chǎn)物為Alisol A。Alisol A 24-acetate和Alisol A為四環(huán)三萜類化合物，是澤瀉的主要活性成分[9]。有研究表明，澤瀉中三萜類成分澤瀉醇A及其醋酸酯，以及澤瀉醇B、C的醋酸酯都能夠降低血清中膽固醇水平，其中澤瀉醇A-24-醋酸酯效果最佳。秦建國(guó)等[10]認(rèn)為,從澤瀉脂溶性成分提取的三萜類化合物澤瀉醇A-24-醋酸酯的降血脂作用最強(qiáng)。許文等[11]通過(guò)用澤瀉水、醇提物干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠胰島素抵抗模型，闡明澤瀉三萜類成分具有較好的降糖作用，其中Alisol A 24-acetate和Alisol A均被證實(shí)能夠明顯地促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖的攝取，進(jìn)而發(fā)揮降糖作用。因此我們推測(cè)花旗澤仁中的Alisol A 24-acetate及其一部分代謝產(chǎn)物Alisol A，共同發(fā)揮降糖、降血脂、降膽固醇的作用[12-13]。

薏苡仁通過(guò)激動(dòng)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)而發(fā)揮降糖降脂作用，其主要活性成分9-羥基-(10E，12E)-十八碳二烯酸(9-HODE)是最強(qiáng)的PPARγ激動(dòng)劑[14-15]。我們?cè)谀蛞?、糞便中檢測(cè)到了9-HODE，且在尿液中檢測(cè)到了相關(guān)代謝物9-oxoODE，代謝產(chǎn)物9-oxoODE可產(chǎn)生類似噻唑烷二酮類(列酮類)降血糖藥的調(diào)節(jié)糖、脂代謝的作用。

綜上所述，本研究通過(guò)分析有效成分及其代謝產(chǎn)物的排泄過(guò)程，探尋花旗澤仁在體內(nèi)的排泄規(guī)律及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。這些內(nèi)容有助于完善花旗澤仁藥代動(dòng)力學(xué)研究，為花旗澤仁的合理用藥提供依據(jù)。

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