回雪穎，郭偉光，滕林，張海麗，于洋

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

下肢深靜脈血栓形成(Deep venous thrombosis，DVT)是周?chē)懿≈谐Ｒ?jiàn)的靜脈系統(tǒng)疾病，屬中醫(yī)學(xué)“股腫”范疇。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠深靜脈血栓形成模型，觀察大黃蟄蟲(chóng)丸對(duì)DVT總一氧化氮合酶(TNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及光、電鏡下靜脈標(biāo)本超微結(jié)構(gòu)的影響，證實(shí)大黃蟄蟲(chóng)丸對(duì)DVT的療效并探討其作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12周齡清潔級(jí)Wistar大鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

一氧化氮合酶(NOS)檢測(cè)分型試劑盒(武漢建成生物工程研究所)。

1.3 主要材料及器械

碘伏消毒液(上海利康消毒高科技有限公司)；組織剪、外科顯微剪、顯微鑷、顯微血管夾等(上海手術(shù)器械廠)；非吸收性外科絲線(杭州華威醫(yī)療用品有限公司)；吸收性明膠海綿(南昌市祥恩堂醫(yī)療器械有限公司)。

1.4 主要儀器

LDZ4-2自動(dòng)平衡離心機(jī)(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；日本OLYMPAUS BH-2光學(xué)顯微鏡；荷蘭TECNAI G2透視電鏡；德國(guó)萊卡2135型切片機(jī)；美國(guó)moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)。

1.5 受試藥物

實(shí)驗(yàn)組使用藥物為大黃蟄蟲(chóng)丸。藥物組成：熟地黃、土蟲(chóng)、水蛭、虻蟲(chóng)、蠐螬、干漆、桃仁、苦杏仁、黃芩、地黃、白芍、甘草。吉林省健今藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z19990064。將大黃蟄蟲(chóng)丸(3 g/丸)用蒸餾水調(diào)勻，制成懸濁液。

對(duì)照組使用藥物為通塞脈片。藥物組成：玄參、金銀花、當(dāng)歸、黃芪、黨參、牛膝、石斛、甘草。江蘇南星藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字232020535。將通塞脈片(0.35 g干浸膏/片)研為細(xì)末，用蒸餾水制成懸濁液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

48只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、大黃蟄蟲(chóng)丸高、中、低劑量組、通塞脈片組、模型組，每組8只，雌雄各半。

按臨床等效劑量為低劑量組得出，大黃蟄蟲(chóng)丸低、中、高劑量分別為0.54 g/kg、1.08 g/kg和2.16 g/kg，通塞脈片用量為0.57 g/kg。灌胃給藥，每次2 ml，每日1次?？瞻讓?duì)照組及模型組采用生理鹽水灌胃，每次2 ml，每日1次。

各組按體質(zhì)量灌胃給藥10天。末次給藥2 h后，以10%的烏拉坦按0.1 ml/kg體質(zhì)量腹腔麻醉，腹中部去毛，常規(guī)消毒，鋪巾，沿腹正中線剪開(kāi)至肌層，腹腔暴露，生理鹽水紗布包裹移出腸管后，將其置于腹部右側(cè)。打開(kāi)后腹膜，游離下腔靜脈與左腎靜脈匯合處，用4#外科非吸收性絲線于左腎靜脈下方結(jié)扎下腔靜脈，將腸管回納腹腔，用1#絲線依次連續(xù)縫合腹壁和皮膚，建立大鼠深靜脈血栓形成模型。術(shù)后6 h，開(kāi)腹，心臟取血，離心10 min取血清，用722型可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定TNOS、iNOS；并取下腔靜脈血管標(biāo)本，分別置于10%甲醛及10%多聚甲醛中固定，鏡檢。

TNOS、iNOS檢測(cè)原理：一氧化氮合酶催化L-精氨酸和分子氧反應(yīng)生成NO，其與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在530 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，依據(jù)吸光度的大小計(jì)算出NOS活力。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

4 結(jié)果

4.1 大黃蟄蟲(chóng)丸對(duì)TNOS、iNOS的影響

如表1所示，大黃蟄蟲(chóng)丸、通塞脈片均可升高模型大鼠的TNOS含量，與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大黃蟄蟲(chóng)丸、通塞脈片均可降低模型大鼠的iNOS含量，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 大黃蟄蟲(chóng)丸對(duì)各組大鼠TNOS、iNOS的影響

注：與模型組比較，▲P<0.05；與空白對(duì)照組比較，★P<0.05，☆P>0.05；與通塞脈片組比較，※P>0.05

4.2 大黃蟄蟲(chóng)丸對(duì)模型大鼠超微結(jié)構(gòu)的影響

4.2.1 光鏡下組織學(xué)觀察

與空白對(duì)照組比較，模型組的血管內(nèi)膜不規(guī)則，血管內(nèi)皮細(xì)胞不全，但其脫落不明顯，管壁不連續(xù)，管腔內(nèi)可見(jiàn)血栓形成，與血管壁無(wú)黏連。大黃蟄蟲(chóng)丸組及通塞脈片組血管內(nèi)膜較規(guī)則，內(nèi)皮相對(duì)完好，部分內(nèi)皮細(xì)胞脫落，血管壁較連續(xù)，管腔內(nèi)可見(jiàn)少量血栓形成，相對(duì)通暢。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠深靜脈血栓形成模型光鏡結(jié)果

4.2.2 電鏡下組織學(xué)觀察

與空白對(duì)照組比較，模型組鏡下可見(jiàn)充滿血栓和炎性細(xì)胞，并可見(jiàn)血小板顆粒特征，可見(jiàn)肌層或表皮中層的破壞。大黃蟄蟲(chóng)丸組及通塞脈片組鏡下可見(jiàn)中膜下有少量滲出及炎性細(xì)胞或中層較完好，內(nèi)皮較連續(xù)，管腔內(nèi)少有聚集血小板，內(nèi)皮細(xì)胞胞漿較飽滿。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠深靜脈血栓形成模型電鏡結(jié)果

5 討論

下肢深靜脈血栓形成多由于創(chuàng)傷、手術(shù)、妊娠及其他長(zhǎng)期臥床等因素所致，發(fā)病率較高。其并發(fā)癥肺栓塞具有致命風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道約有50%的DVT患者由于認(rèn)識(shí)不足、延誤治療演變成下肢深靜脈血栓形成后遺癥(Deepvenous postthrombotic syndrome DVTS)[1-3]，包括下肢腫脹、色素沉著、潰瘍等，嚴(yán)重影響患者的日常生活和工作。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,深靜脈血栓形成屬于“股腫”“脈痹”等范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有對(duì)本病的描述?！堆C論》指出：“瘀血流注，亦發(fā)腫脹，乃血變成水之證。”《醫(yī)宗金鑒》提到：“產(chǎn)后閃挫，瘀血作腫者，瘀血久滯于經(jīng)絡(luò)，忽發(fā)則木硬不紅微熱。”故本病是因創(chuàng)傷、產(chǎn)后或術(shù)后長(zhǎng)期臥床導(dǎo)致氣虛或氣滯，使血行不暢，瘀阻脈絡(luò)，營(yíng)血回流受阻，聚而為濕所致?！秲?nèi)經(jīng)》提到“血實(shí)者宜決之”，用大黃蟄蟲(chóng)丸以祛瘀生新。大黃蟄蟲(chóng)丸源自張仲景的《金匱要略》，具有攻補(bǔ)兼施的特點(diǎn)。方中大黃清熱活血化瘀，《本經(jīng)》中描述其：“下瘀血，血閉寒熱，破癥瘕積聚”；蟄蟲(chóng)破血逐瘀，《長(zhǎng)沙藥解》曰：“(蟄蟲(chóng))本品善化瘀血，最補(bǔ)損傷”，二者共為君藥，能行能和，通達(dá)三焦以除瘀血。臣以水蛭、虻蟲(chóng)、蠐螬、煅干漆、桃仁活血搜絡(luò)化瘀，共助君藥攻逐瘀血，《本經(jīng)》中介紹水蛭“主逐惡血、瘀血”；虻蟲(chóng)“逐瘀血，破下血積”；《長(zhǎng)沙藥解》：“蠐螬，能化瘀血，最消癥塊?！薄墩渲槟摇贰?桃仁)治血結(jié)……，破蓄血”。佐以黃芩清解郁熱；苦杏仁宣肺氣，潤(rùn)腸道，配伍桃仁，降肺氣，開(kāi)大腸以利瘀血；地黃、白芍養(yǎng)血潤(rùn)燥，緩中補(bǔ)虛，以助生新。甘草益氣和中，調(diào)和藥性，為佐使藥。

諸藥合用，祛瘀而不傷正，扶正而不留瘀。蟲(chóng)類(lèi)藥物，搜剔鉆透，直達(dá)病所，合用后破血逐瘀之力峻猛，瘀血重癥，非其不足以祛除。此方體現(xiàn)張仲景用藥嚴(yán)謹(jǐn)，寓意良深。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為血流緩慢、血液高凝和靜脈壁損傷是靜脈血栓形成三大因素[4]。總一氧化氮合酶(TNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)可引起血液高凝狀態(tài)。TNOS有三種亞型同功酶，包括神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS )以及iNOS，其中iNOS正常情況下在細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)，只有在損傷后誘導(dǎo)表達(dá)[5]。iNOS激活后活性持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可誘導(dǎo)持續(xù)大量釋放超出生理濃度的一氧化氮[6]，活性氮氧終產(chǎn)物生成增多，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞壞死，釋放更多的炎性介質(zhì)，從而易形成血栓?，F(xiàn)代藥理研究表明，蟄蟲(chóng)中含有絲氨酸蛋白酶，可以激活人體血纖溶酶原。水蛭素有抗凝、抗血栓、抗血小板凝聚作用，促進(jìn)新生血管的生成[7]，水蛭素和凝血酶結(jié)合后可抑制凝血酶上的纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn)，使纖維蛋白原不能轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，從而抑制凝血過(guò)程[8]。桃仁有抗凝作用，對(duì)血流阻滯、血行障礙有改善作用。

本研究中大黃蟄蟲(chóng)丸能夠降低模型大鼠血清中的iNOS，升高血清中的TNOS含量。光鏡及電鏡下血栓模型組血管內(nèi)皮不同程度破壞，但大黃蟄蟲(chóng)丸能顯著改善其狀態(tài)，且高劑量組保護(hù)血管內(nèi)皮比中、低劑量組明顯。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明大黃蟄蟲(chóng)丸有良好的預(yù)防血栓及保護(hù)內(nèi)皮作用，為臨床應(yīng)用提供了可靠的理論依據(jù)。

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