張麗宏，傅云，王業(yè)秋，廖建，張艷紅，李建民*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.資陽川中醫(yī)院，四川 資陽 641300)

近幾年，工業(yè)化生產(chǎn)日益增加，臭氧層遭到嚴(yán)重破壞，皮膚傷害也逐漸增加，主要表現(xiàn)為紅斑、皺縮、粗糙、無光澤，嚴(yán)重可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[1]。隨著人們對(duì)美容的重視，皮膚光老化越來越引起人們關(guān)注，探索中藥預(yù)防及治療皮膚光老化已成當(dāng)今研究熱點(diǎn)。

甘草為豆科甘草屬植物的根和根莖，甘草酸是甘草根部提取物中含量較高的重要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗變態(tài)反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫、抑制黑色素沉著、抗癌等作用[2-3]。甘草酸具有較好的光熱穩(wěn)定性，可修復(fù)UV輻射導(dǎo)致的皮膚炎癥[4]。目前，對(duì)有效成分甘草酸抗皮膚光老化的機(jī)制研究尚不明確，本實(shí)驗(yàn)采用30 mJ/cm2UVB照射HaCaT細(xì)胞，建立光老化模型，用不同濃度甘草酸作用于光老化HaCaT細(xì)胞，探討甘草酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞 HaCaT(中喬新舟)；胎牛血清 FBS(Hyclone 公司，批號(hào)NYB0614)；DMEM 培養(yǎng)液(Hyclone 公司，批號(hào)NZM1301)；雙抗(Hyclone 公司，批號(hào)20161230)；磷酸鹽緩沖液 PBS(北京中山金橋有限公司，批號(hào)20160509)；胰蛋白酶(Billab 公司，批號(hào)J120028)；四甲基噻唑藍(lán) MTT(Sigma 公司，批號(hào)021005)；二甲基亞砜 DMSO(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20160716)；SOD 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20170522)；GSH 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20170518)；CAT 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20170523)；RIPA細(xì)胞裂解液及 PMSF 蛋白酶抑制劑(碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗人β-actin 單克隆抗體(博奧森生物有限公司)；兔抗人IL-1β、IL-6、TNF-α多克隆抗體(博奧森生物有限公司)；羊抗兔二抗(博士德生物有限公司)；甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特，批號(hào)MUST-16081812)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

生物潔凈工作臺(tái)(BCM-1000A 型)；蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱(HF240型)；上海力申科學(xué)儀器有限公司；Olympus 倒置顯微鏡(IX-71-21PH 型,日本Olympus 株式會(huì)社)；酶標(biāo)儀(MK3 型，上海熱電儀器有限公司)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(ETR16-2型，上海安亭科學(xué)儀器廠)；DYY-10C 型電泳儀(北京六一儀器廠)；Smart chemi Ⅱ型一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 10%DMEM培養(yǎng)液的配制

DMEM培養(yǎng)基：FBS：P/S=89:10:1，混勻，4℃保存。

2.2 藥物配制

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定甘草酸濃度大于10-5mol/L時(shí)對(duì)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生毒性，本實(shí)驗(yàn)將甘草酸加入DMEM培養(yǎng)液中，配制成10-3mol/L的藥物母液，在實(shí)驗(yàn)需要時(shí)將母液稀釋成10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L 三個(gè)濃度，調(diào)pH值至7.0，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期，胰酶消化，離心，并使用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)/孔將細(xì)胞接種至96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，以1×106個(gè)/孔將細(xì)胞接種至6孔板，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.4 MTT法檢測(cè)甘草酸對(duì)光老化HaCaT增殖率影響

96孔板內(nèi)細(xì)胞隨機(jī)分為空白組，模型組，10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L甘草酸組。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加200 μL PBS，使用鋁箔紙將空白組覆蓋，用30 mJ/cm2UVB照射模型組和甘草酸組，照射完畢，棄去PBS，甘草酸組加入不同梯度濃度的甘草酸，模型組和空白組加入等量培養(yǎng)液，孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/ml)，孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，37℃恒溫培養(yǎng)震蕩器上震蕩10 min，在酶標(biāo)儀492 nm波長處測(cè)定吸光度值。

2.5 試劑盒檢測(cè)HaCaT細(xì)胞中GSH、SOD及CAT活性

6孔板細(xì)胞參照“2.4”項(xiàng)下方式建立光老化模型。待細(xì)胞生長密度達(dá)80%～90%時(shí)，收集6孔板中各組細(xì)胞，PBS洗2次，RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF以99:1混勻，按照100 μL/孔加入混合液，冰盒上靜置30 min，4℃，13 200 rpm的條件下離心15 min，在冰盒上收集上清液于離心管中，按照試劑盒說明書檢測(cè)各組細(xì)胞中GSH、SOD及CAT活性。

2.6 Western Blot法檢測(cè)HaCaT中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量

收集6孔板中各組細(xì)胞，使用RIPA和PMSF混合液提取蛋白，BCA法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度，每孔加樣20 μL，SDS-PAGE電泳60 min，半干轉(zhuǎn)膜30 min，室溫封閉2 h，加入一抗孵育，4℃過夜，TBST洗膜三次，加二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜三次，加入ECL顯色，使用發(fā)光成像儀拍攝，利用Lane ID 凝膠軟件分析各條帶的灰度值，以目的條帶灰度值和內(nèi)參條帶灰度值的比值，反映目的蛋白的表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 甘草酸對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖率影響

見表1。與空白組相比，模型組細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，10-7、10-6、10-5mol/L甘草酸組細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.01)。

表1 甘草酸對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖率影響

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01

3.2 甘草酸對(duì)HaCaT細(xì)胞中SOD、GSH及CAT活性的影響

見表2。與空白組相比，模型組SOD、GSH、CAT 活性顯著性降低(P<0.01)。與模型組相比，10-7、10-6、10-5mol/L甘草酸組SOD、GSH及CAT活性顯著升高(P<0.01)，隨著濃度的增大，SOD、GSH及CAT活性逐漸升高。由此可知，10-7、10-6、10-5mol/L的甘草酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用對(duì)甘草酸的濃度有一定的依耐性。

表2 甘草酸對(duì)HaCaT細(xì)胞中SOD、GSH及CAT活性的影響

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01

3.3 甘草酸對(duì)HaCaT細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量的影響

由表3和圖1可知，與空白組相比，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，10-7mol/L 甘草酸組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，10-6、10-5mol/L甘草酸組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。

表3 甘草酸對(duì)HaCaT 細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量的影響

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

圖1 甘草酸對(duì)HaCaT細(xì)胞中IL-1β、IL-6、 TNF-α蛋白表達(dá)量的影響注：A：空白組；B：模型組；C：10-7 mol/L甘草酸組；D：10-6 mol/L甘草酸組；E：10-5 mol/L甘草酸組

4 討論

角質(zhì)形成細(xì)胞位于人體皮膚最表層，是UVB 輻射的主要靶細(xì)胞，長期的UVB輻射將導(dǎo)致皮膚光老化，甚至發(fā)生癌變[5-6]。TNF-α作為機(jī)體中廣泛分布的關(guān)鍵促炎因子，具有介導(dǎo)炎癥、免疫應(yīng)答和凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)[7-9]，可促進(jìn)多種細(xì)胞炎癥因子如 IL-1β，IL-6，IL-8 和 IL-12 等的合成[10-11]。在機(jī)體受到外界刺激時(shí)，IL-1β是具有免疫調(diào)節(jié)和執(zhí)行宿主防御功能的炎癥因子[12]，可以刺激角質(zhì)形成細(xì)胞中表皮生長因子受體，誘導(dǎo)ERK途徑的磷酸化，導(dǎo)致MMP-1的表達(dá)增加，從而加速膠原蛋白的降解，促進(jìn)光老化的發(fā)生[13]。IL-6通過自分泌機(jī)制誘導(dǎo)MMP-1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解，誘導(dǎo)皮膚光老化[14]。因此，IL-1β、IL-6以及TNF-α在UVB誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞光老化的過程中起著至關(guān)重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，30 mJ/cm2UVB輻射角質(zhì)形成細(xì)胞后，模型組SOD、GSH、CAT 活性降低，IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量升高；而加入藥物處理后，10-7、10-6、10-5mol/L甘草酸組SOD、GSH、CAT活性升高，IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量降低。分析其原因，甘草酸可通過提高SOD、GSH及CAT活性，清除體內(nèi)氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，與此同時(shí)，甘草酸還可通過減少炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生，抵抗UVB輻射對(duì)細(xì)胞造成的光損傷。

甘草酸作為我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥甘草中的一種天然藥物活性成分，可保護(hù)紫外線對(duì)皮膚造成的光損傷，在日后防護(hù)紫外線產(chǎn)品的研究開發(fā)中具有重要參考價(jià)值，有望開發(fā)成為臨床可用的新型抗皮膚光老化藥物。

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