胡曉陽(yáng)，蔣皓，鄒尚亮，張雙良

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；3.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000)

酒精性肝損傷(Alcoholic Liver Disease,ALD)是指因過(guò)量飲酒導(dǎo)致的肝臟病理性損傷[1]。在組織病理學(xué)上主要表現(xiàn)為以下4種逐漸遞進(jìn)的形式：酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化，這4種損傷形式可單獨(dú)或混合存在[2-3]。酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，因其涉及到酒精與其代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟產(chǎn)生的直接或間接作用，同時(shí)酒精性肝損傷的發(fā)生、進(jìn)展還與遺傳易感性及營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)密切關(guān)聯(lián)。全世界有大約1 500萬(wàn)～2 000萬(wàn)人酗酒，這其中就有10%～20%的人發(fā)生酒精性肝損傷[4]。酒精性肝損傷是發(fā)達(dá)國(guó)家肝硬化的主要致病原因(占80%～90%)，也是導(dǎo)致青壯年死亡的主要原因[5]。近年隨著中國(guó)居民生活水平的提高，嗜酒者逐漸增多，酒精性肝損傷的發(fā)生率呈逐年上升的趨勢(shì)，酒精已成為繼病毒性肝炎之后導(dǎo)致肝損傷的第二大病因[6-7]，因此對(duì)酒精性肝損傷的研究日漸引起人們的廣泛關(guān)注。

尖葉假龍膽為龍膽科假龍膽屬下的一個(gè)種，也叫苦龍膽，葉披針形，寬3～7 mm；花萼長(zhǎng)7～10 mm，萼簡(jiǎn)短，花冠長(zhǎng)9～12 mm，裂片具流蘇狀副冠。生于濕草地，產(chǎn)于黑龍江、內(nèi)蒙古[8]。該藥味苦，具有清熱、利濕之功，主要在民族醫(yī)學(xué)中的藏醫(yī)、蒙醫(yī)學(xué)中使用，用于治療黃疸、肝炎、膽囊炎、頭痛、發(fā)熱等疾病，療效顯著。《蒙植藥志》記載其為阿古特-其其格，并認(rèn)為其全草可治黃疸，頭痛，發(fā)熱，口干，未成熟熱，膽熱，并有治療黃疸型肝炎，膽囊炎，心絞痛，發(fā)燒，外傷感染的記載。鄂倫春族用以治療心律失常等心臟病[9]?，F(xiàn)代對(duì)于尖葉假龍膽的藥效學(xué)研究主要集中在保肝、抗心律失常、抗氧化、降糖、抗心肌纖維化等方面[10-11]?，F(xiàn)代研究證實(shí),尖葉假龍膽具有顯著的抗氧化活性以及對(duì)某些代謝酶的調(diào)節(jié)作用，ALD發(fā)病主要是由氧化應(yīng)激、某些基因的激活參與，因此尖葉假龍膽可能具有防治ALD的功效。

1 材料

1.1 陽(yáng)性藥液的制備

東寶甘泰片(吉林通化東寶藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)141203)粉碎后以蒸餾水將其稀釋成0.04 g/ml的溶液，陽(yáng)性藥組大鼠給藥量為10 ml/kg,相當(dāng)于臨床成人常用量的6.25倍。

1.2 尖葉假龍膽高、中、低濃度藥液的制備

尖葉假龍膽全草采自黑龍江大興安嶺地區(qū)漠河縣，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為Gentianellaacuta的全草。尖葉假龍膽全草1 kg粉碎，以75%乙醇20 L浸泡于圓底燒瓶中2 h，加熱回流提取、過(guò)濾2次，二次藥液混合，于連接循環(huán)水真空泵的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮，得尖葉假龍膽浸膏，待用。加蒸餾水稀釋至2 L，相當(dāng)于含生藥材濃度為0.50 g/ml，此為高濃度；取出1 L加蒸餾水1 L，相當(dāng)于0.25 g/ml,此為中濃度；取中濃度1 L，加蒸餾水1 L，相當(dāng)于0.13 g/ml,此為低濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，由哈爾濱育英養(yǎng)殖場(chǎng)提供，許可證編號(hào)：SCXK(黑)2013-001。將小鼠置于室溫，給予標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室食物和充足的淡水。遵循國(guó)家制定的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 大鼠酒精性肝損傷模型的建立及取材

本實(shí)驗(yàn)采用酒精灌胃法[1]建立大鼠酒精性肝損傷模型。將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別是空白組、模型組、陽(yáng)性藥組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除正常喂養(yǎng)外，模型組，陽(yáng)性藥組，高、中、低劑量組均給予梯度50%乙醇灌胃，即：第1周2 ml/kg,第2周4 ml/kg,第3周6 ml/kg,從第4周開(kāi)始到第8周結(jié)束7 ml/kg；空白組給予等量生理鹽水。第7～8周高、中、低劑量組分別給予相應(yīng)濃度的尖葉假龍膽稀釋液10 ml/kg,陽(yáng)性藥組給予東寶肝泰稀釋液10 ml/kg,空白組、模型組給予生理鹽水10 ml/kg。末日晚8時(shí)開(kāi)始禁食水，20%烏拉坦溶液5 ml/kg腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血后4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，分離血清；取出完整肝臟，生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱重并做記錄，計(jì)算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)(%)=肝重/體質(zhì)量×100%

2.2 生化指標(biāo)的測(cè)定

天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)151231)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)152421)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20151014)；谷胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20151021)。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)應(yīng)用單因素方差分析以及Dunnett＇s檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)定為α=0.05，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 尖葉假龍膽對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝臟指數(shù)的影響

與空白組相比，模型組肝指數(shù)明顯升高(P<0.05)，差異顯著；與模型組相比，陽(yáng)性藥組、高劑量組、中劑量組、低劑量組肝臟指數(shù)均降低(P<0.05),差異均顯著；與陽(yáng)性藥組比較，高劑量組、低劑量組肝指數(shù)均降低(P<0.05)，差異顯著，中劑量組肝指數(shù)變化不明顯(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 尖葉假龍膽對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠血清AST、ALT的影響

與空白組相比，模型組大鼠血清ALT濃度明顯升高(P<0.01)，差異極顯著；與模型組相比，陽(yáng)性藥組、高劑量組、中劑量組、低劑量組大鼠血清ALT濃度均降低(P<0.05)，差異顯著；與陽(yáng)性藥組相比，高、中、低劑量組ALT濃度均降低(P<0.05)，差異顯著；與高劑量組相比，中劑量組ALT濃度降低(P<0.05)，差異顯著，低劑量組變化不明顯(P>0.05)。

與空白組相比，模型組大鼠血清AST濃度明顯升高(P<0.01)，差異極顯著；與模型組相比，陽(yáng)性藥組、高劑量組、中劑量組、低劑量組AST濃度均明顯降低(P<0.05)，差異顯著；與陽(yáng)性藥相比，高劑量組AST濃度降低明顯(P<0.01)，差異極顯著，中劑量組、低劑量組降低明(P<0.05)，差異顯著；與高劑量組相比，中劑量組AST濃度升高明顯(P<0.05)，低劑量組AST濃度降低明顯(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 尖葉假龍膽對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝臟 指數(shù)的影響

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與陽(yáng)性藥組相比，ΔP<0.05

表2 尖葉假龍膽對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清AST、 ALT含量的影響

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，ΔP<0.05；與陽(yáng)性藥相比，#P<0.05，##P<0.01；與高劑量組相比，☆P<0.05，☆☆P<0.01

3.3 尖葉假龍膽對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝組織SOD、GSH含量的影響

與空白組相比，模型組SOD活力濃度明顯降低(P<0.01)，差異極顯著；與模型組相比，尖葉假龍膽中劑量組SOD活力濃度明顯升高(P<0.01)，差異顯著，陽(yáng)性藥組、高劑量組、低劑量組變化不明顯(P>0.05)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與空白組相比，模型組GSH含量明顯降低(P<0.01)，差異極明顯；與模型組相比，尖葉假龍膽高劑量組GSH含量明顯升高(P<0.01)，差異極顯著，中、低劑量分組變化不明顯(P>0.05)；與尖葉假龍膽高劑量組相比，中、低劑量組GSH含量明顯低(P<0.01，P<0.01)，差異極顯著，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 尖葉假龍膽對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝組織SOD、 GSH活力或含量的影響

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，ΔΔP<0.01；與高劑量組相比，☆☆P<0.01

4 討論

肝指數(shù)為肝臟濕重與大鼠體質(zhì)量的比值，長(zhǎng)期過(guò)量飲酒導(dǎo)致酒精性肝損傷時(shí)，肝細(xì)胞腫脹變大，顯水樣變。當(dāng)肝臟發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂后，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪的淤積，發(fā)生脂肪變，使肝臟體積進(jìn)一步增大，重量增加；當(dāng)肝細(xì)胞的微管受損傷后，分泌功能受到阻礙，使得分泌性蛋白滯留在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞發(fā)生氣球樣變，體積增加，重量也增加，肝指數(shù)升高[12]。從該實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，酒精性肝損傷造模成功，高、中、低劑量組肝指數(shù)均較模型組降低，且差異明顯，但尖葉假龍膽各劑量組之間無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：尖葉假龍膽能夠?qū)凭愿螕p傷大鼠肝臟起到保護(hù)作用。

轉(zhuǎn)氨酶的異常升高是肝臟疾病的標(biāo)志[13]，從各組大鼠肝損傷指標(biāo)AST、ALT的活性可以看出尖葉假龍膽具有保肝作用，這兩種酶都存在肝細(xì)胞內(nèi)，正常情況下在血清中含量很少，當(dāng)肝臟受到損害，肝細(xì)胞膜的通透性增加，大量的AST、ALT釋放入血，引起血中這兩種酶的濃度升高，AST主要分布于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)，因此除非肝細(xì)胞線粒體也受到損傷，否則血清中AST濃度不會(huì)升高太多，應(yīng)用尖葉假龍膽的實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中這兩種酶的濃度明顯低于模型組，證明尖葉假龍膽對(duì)于增加肝細(xì)胞膜的穩(wěn)定性確有作用。ALT與AST主要分布在肝臟的肝細(xì)胞內(nèi)，肝細(xì)胞壞死時(shí)ALT和AST就會(huì)升高。谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi),細(xì)胞內(nèi)ALT濃度高于血清中1 000～3 000倍,正常時(shí)血清的含量很低，當(dāng)肝細(xì)胞受損后，肝細(xì)胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)的ALT、AST釋放入血漿，使得血清ALT、AST的酶活性升高，只要有1%肝細(xì)胞受損，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性即升高一倍，因此，谷丙轉(zhuǎn)氨酶被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo),其升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指標(biāo)。與ALT不同的是，大約80% AST存在于肝細(xì)胞線粒體中[14]，因此，不同類(lèi)型的肝損傷，ALT和AST升高的程度及其AST/ALT的比值是不一樣的。急性肝炎和慢性肝炎的輕型，雖有肝細(xì)胞的損傷，肝細(xì)胞的線粒體仍保持完整，故釋放入血的只有存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的ALT，所以主要表現(xiàn)為ALT的升高。重型肝炎和慢性肝炎的中型和重型，肝細(xì)胞的線粒體也遭到了嚴(yán)重的破壞，AST從線粒體和胞漿內(nèi)釋出，因而表現(xiàn)出AST升高多于ALT。肝硬化和肝癌患者，肝細(xì)胞的破壞程度更加嚴(yán)重，線粒體也受到了嚴(yán)重的破壞，因此，AST升高明顯多于AST。酒精性肝病的患者，AST的活性也常常大于ALT。各實(shí)驗(yàn)組ALT活性均降低，說(shuō)明尖葉假龍膽對(duì)肝臟有保護(hù)作用，但中、低劑量組效果明顯強(qiáng)于高劑量組；對(duì)于AST活性的影響，各實(shí)驗(yàn)組均有降低作用，說(shuō)明對(duì)肝臟具有保護(hù)作用，但低劑量組效果最明顯。

一定濃度的尖葉假龍膽提取液能夠提升酒精性肝損傷大鼠肝組織中SOD活力以及GSH含量，從而對(duì)肝臟具有保護(hù)作用。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，能夠清除超氧陰離子自由基,保護(hù)細(xì)胞免受損傷[15]。人們認(rèn)為自由基(也稱游離基)與絕大部分疾病以及機(jī)體的衰老有關(guān)。由于自由基非?；顫姡瘜W(xué)反應(yīng)性極強(qiáng)，參與一系列的連鎖反應(yīng)，能引起細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞了膜的結(jié)構(gòu)和功能。并且能引起蛋白質(zhì)變性和交聯(lián)，使體內(nèi)的許多酶及激素失去生物活性，機(jī)體的免疫能力、神經(jīng)反射能力、運(yùn)動(dòng)能力等系統(tǒng)活力降低，同時(shí)還能破壞核酸結(jié)構(gòu)和導(dǎo)致整個(gè)機(jī)體代謝失常等，最終使機(jī)體發(fā)生病變。因此，自由基作為機(jī)體垃圾，能夠促使某些疾病的發(fā)生和機(jī)體的衰老。雖然自由基會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生諸多危害，但是在一般的條件下機(jī)體細(xì)胞內(nèi)也存在著清除自由基、抑制自由基反應(yīng)的體系，有的屬于抗氧化酶類(lèi)，有的屬于抗氧化劑。SOD就是一種主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及預(yù)防衰老等方面起著重要作用。SOD能專一地清除體內(nèi)有害的自由基，以解除自由基氧化體內(nèi)的某些組成成分而造成的機(jī)體損害。GSH是一種低分子清除劑，它可清除O2、H2O2、LOOH(過(guò)氧化脂)。GSH是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽，是組織中主要的非蛋白質(zhì)的巰基化合物，并且是GSH-Px和GST兩種酶類(lèi)的底物，為這二種酶分解氫過(guò)氧化物所必需，能穩(wěn)定含巰基的酶和防止血紅蛋白及其他輔因子受氧化損傷，GSH量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。酒精性肝損傷進(jìn)展過(guò)程中,會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基會(huì)對(duì)機(jī)體造成氧化損傷，同時(shí)大量的氧自由基作用于脂質(zhì)，使其發(fā)生氧化反應(yīng)最終生成MDA,后者會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，對(duì)細(xì)胞具有毒性作用，會(huì)加劇膜的損傷。實(shí)驗(yàn)組大鼠應(yīng)用尖葉假龍膽后抗氧化損傷能力明顯增強(qiáng)，肝組織中SOD水平明顯升高，高劑量組血清中GSH含量也上升明顯，這些改變均有助于減輕大鼠因飲酒導(dǎo)致的肝臟氧化損傷。

[1] 儲(chǔ)蘭蘭,許猛,王妍,等.小鼠急性酒精性肝損傷模型氧化損傷指標(biāo)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2017,44(14):2605-2608,2622.

[2] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.酒精性肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中華肝臟病雜志,2003,2(11):72.

[3] 陶倫.酒精性肝損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2011,8(5):187-188.

[4] DAY C P.Apoptosis in alcoholic hepatitis: a novel therapeutic target[J].Journal of hepatology,2001,34(2):330-333.

[5] ANNA MAE DIEHL.Liver disease in alcohol abusers:clinical perspective[J].Alcohol,2002,27(1):7-11.

[6] 莊輝.酒精性肝病的流行病學(xué)[J].中華肝臟病雜志,2003,11(11):689-689.

[7] 劉銀華，戚之琳，徐國(guó)祥，等.連翹苷對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2016，21(1)：6-9.

[8] 溥沛云.東北植物檢索表[M].北京:科學(xué)出版社,1995:516-520.

[9] 烏尼爾,春亮,哈斯巴根.內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)鄂溫克族民間藥用植物調(diào)查[J].中國(guó)野生植物資源,2008,27(6):27-29.

[10] 王晶晶.尖葉假龍膽對(duì)心肌纖維化的影響及其作用機(jī)制[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué),2015:32.

[11] 董壯,李冀.尖葉假龍膽與秦艽配伍對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠相關(guān)炎性因子的影響[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(3):75-78.

[12] 江正輝,王泰齡.酒精性肝損傷[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2001:147-149.

[13] 吳誠(chéng),呂著海,沈存思,等.養(yǎng)元飲對(duì)酒精性肝損傷大鼠解酒和保肝作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010,16(14):150-153.

[14] 陳文斌,潘祥林.診斷學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:368.

[15] 李海燕,李夏,金向群,等.黃芩苷對(duì)大鼠慢性酒精性肝損傷的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2008,14(6):58-60.