佘麗嬌 孫 晶 沈 醉 何俏穎 方劍喬 邵曉梅

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，杭州310053）

當(dāng)個(gè)體受到外界刺激引起了組織損傷或潛在損傷都可能產(chǎn)生疼痛，許多病人在疾病過(guò)程中承受持續(xù)的疼痛，甚至當(dāng)初始病灶痊愈后疼痛仍然存在，這一現(xiàn)象被稱為“痛記憶”[1,2]。以痛覺(jué)過(guò)敏和痛覺(jué)超敏為特征的疼痛狀態(tài)在大腦中逐漸形成相關(guān)記憶與負(fù)面情緒，這一過(guò)程由疼痛的獲得、鞏固以及恢復(fù)組成[3]。疼痛的最初記憶可因情緒成分的夾雜而加重，進(jìn)而形成更多更復(fù)雜的記憶[3]。這一特別現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)引起了眾多研究者的興趣。部分研究提出痛覺(jué)神經(jīng)元獲得并將疼痛信號(hào)傳遞至大腦相關(guān)核團(tuán)，例如前扣帶皮層 (anterior cingulate cortex，ACC)、前額葉皮層、海馬體、杏仁核和島葉皮層，并通過(guò)短期記憶情緒環(huán)境下的反復(fù)和持續(xù)刺激繼而形成長(zhǎng)期記憶[4,5]。另有研究表明，痛記憶可能是由于首次炎癥疼痛恢復(fù)后，大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性的改變引起的[4]。針對(duì)痛記憶現(xiàn)象的改善目前還沒(méi)有明確的治療手段。臨床上用于治療和改善長(zhǎng)期疼痛和慢性疼痛常用的非甾體抗炎藥 (non-steroid anti-in flammatory drugs, NSAIDs)，例如水楊酸類的阿司匹林、吲哚類的吲哚美辛以及丙酸類的布洛芬及芬必得等，雖然具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛療效[5]，但未有研究明確其對(duì)痛記憶是否有干預(yù)作用，且由于非甾體抗炎藥物的胃腸道不良反應(yīng)[6]，很大程度上限制了這類藥物在疼痛類疾病治療中的長(zhǎng)期應(yīng)用。因此，尋求改善痛記憶現(xiàn)象的有效方法顯得尤為必要。

電針廣泛應(yīng)用于中醫(yī)針灸臨床鎮(zhèn)痛，且療效確切[7~9]。研究者從外周、中樞等多個(gè)水平應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與方法闡述了針刺鎮(zhèn)痛的部分機(jī)制，并取得了較大的進(jìn)展[10~12]。但鮮有關(guān)于探討電針對(duì)痛記憶干預(yù)效應(yīng)的研究，本研究以角叉菜膠足跖二次交叉注射誘發(fā)痛記憶模型，觀察不同時(shí)間電針和吲哚美辛干預(yù)痛記憶的效應(yīng)差異，篩選治療痛記憶的最佳介入時(shí)間和方案，為臨床治療該類疾病提供理論依據(jù)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠，體重180 ±200 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016]，實(shí)驗(yàn)中操作均遵照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見(jiàn)》。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)4～5天，飼養(yǎng)期間自由攝食及飲水，分籠飼養(yǎng)，12 h晝夜循環(huán)光照，室內(nèi)溫度控制在（22±2）℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為六組，每組10只，分別為對(duì)照組（Control組）、角叉菜膠炎性痛模型組（Model組）、角叉菜膠首次造模加電針組（EA1組）、角叉菜膠二次造模加電針組（EA2組）、角叉菜膠首次造模加吲哚美辛灌胃組（Indo1組）以及角叉菜膠二次造模加吲哚美辛灌胃組（Indo2組）。

2.實(shí)驗(yàn)方法

（1）痛記憶模型制備

實(shí)驗(yàn)中Model組、EA1組及EA2組大鼠均采用Igor Kissin[13]等人提出的角叉菜膠足跖二次交叉注射誘導(dǎo)的痛記憶模型。首次造模，在大鼠左后足跖皮下注射2%角叉菜膠0.1 ml（美國(guó)SIGMA公司批號(hào)：1408463V）；14天后，各組大鼠痛閾恢復(fù)至基礎(chǔ)痛閾水平，在大鼠右側(cè)足跖皮下二次注射同劑量的角叉菜膠。觀察二次注射后大鼠左側(cè)足跖的痛閾變化，痛閾降低則表明痛記憶造模成功。相同時(shí)間點(diǎn)，Control組大鼠則注射相同劑量的0.9%生理鹽水（杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司批號(hào)：11210283）。

（2）電針治療及其他處理

角叉菜膠首次注射后，EA1組選取大鼠雙側(cè)后肢“足三里”穴，采用韓式穴位神經(jīng)刺激儀(HANS-200E)連接針灸針（0.25 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠）進(jìn)行電針干預(yù)。電針?lè)謩e連接左右兩側(cè)的“足三里”穴和參考電極（足三里后下1 cm）。刺激參數(shù)為疏密波2/100 Hz，強(qiáng)度1～2 mA（每10 min增加0.5 mA），時(shí)間30 min。干預(yù)時(shí)間分別為一次注射后4 h、1～5 d行為學(xué)檢測(cè)前進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)6次。EA2組大鼠于角叉菜膠二次注射后進(jìn)行電針干預(yù)，選穴和刺激參數(shù)與EA1組相同，干預(yù)時(shí)間為二次注射后4 h、1～3 d行為學(xué)檢測(cè)前，連續(xù)4次。Model組大鼠于相同時(shí)間點(diǎn)作與電針干預(yù)組大鼠相同的固定處理。Indo1組大鼠與EA1組大鼠于相同時(shí)間點(diǎn)，以吲哚美辛（山西云鵬制藥有限公司批號(hào)：H14020771）按3 mg/kg劑量灌胃，連續(xù)6次。Indo2組大鼠采用相同方法與EA2組大鼠同時(shí)間點(diǎn)操作，連續(xù)4次，觀察其痛閾的變化。

（3）機(jī)械痛閾檢測(cè)

采用據(jù)經(jīng)典von Frey絲法[14]改良的動(dòng)態(tài)足底觸覺(jué)儀（意大利UGO BASIL公司型號(hào)：37450）在一次和二次注射前檢測(cè)大鼠雙側(cè)后足跖縮足閾(paw withdrawal thresholds, PWTs)作為基礎(chǔ)痛閾值。然后分別檢測(cè)一次注射后4 h、1 d、3 d、5 d及二次注射后4 h、1 d、2 d、3 d的機(jī)械痛閾值。檢測(cè)時(shí)，將大鼠單獨(dú)放入底面為鐵絲網(wǎng)的有機(jī)玻璃盒中，室內(nèi)溫度保持23～25℃，濕度45%～55%，噪音40 dB以下，休息約20 min左右，待大鼠安靜后開(kāi)始檢測(cè)。不銹鋼探針（直徑0.5 mm）垂直上升至大鼠后足掌底中部（避開(kāi)足墊）后，以2.5 g/s的速度逐漸增大刺激強(qiáng)度，以大鼠縮足或刺激量達(dá)到最大值（50 g）為準(zhǔn)，儀器自動(dòng)記錄縮足時(shí)探針觸力。大鼠雙側(cè)足跖連續(xù)檢測(cè)5次，每次間隔約5 min，計(jì)算其后4次平均值。檢測(cè)時(shí)間置于上午9點(diǎn)至下午3點(diǎn)間。各組大鼠于基礎(chǔ)痛閾測(cè)量前進(jìn)行兩天適應(yīng)性痛閾的檢測(cè)，以減少實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)大鼠痛閾的影響。

5．統(tǒng)計(jì)方法與分析

采用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±SEM）表示。PWTs數(shù)據(jù)多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較，方差齊性時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett' s T3檢驗(yàn)；每組間造模前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.痛記憶模型

如圖1示，圖1A和圖1B為各組大鼠角叉菜膠首次注射前后左側(cè)（注射側(cè)）和右側(cè)（未注射側(cè)）足跖各時(shí)段的痛閾變化。從圖1A可見(jiàn)首次造模前，各組大鼠造模側(cè)（左側(cè)）足跖基礎(chǔ)痛閾無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。造模后4 h、3 d及5 d測(cè)得大鼠痛閾，與Control組相比，Model組大鼠痛閾明顯降低(P< 0.05)。從圖1B可見(jiàn)各組大鼠未造模側(cè)（右側(cè)）各時(shí)段足跖痛閾均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖1C和1D為各組大鼠角叉菜膠二次造模前后大鼠雙側(cè)足跖的痛閾變化。14 d后各組大鼠雙側(cè)足跖基礎(chǔ)痛閾已恢復(fù)正常，此時(shí)開(kāi)始對(duì)之前未造模側(cè)（右側(cè)）足跖進(jìn)行角叉菜膠二次造模。如圖1C所示，與Control組相比，Model組大鼠未造模側(cè)(左側(cè))足跖痛閾在二次造模后1～3 d明顯下降(P< 0.05)。如圖1D所示，與Control組相比，Model組大鼠造模側(cè)（右側(cè)）足跖痛閾在4 h、1～3 d明顯下降(P< 0.05)。二次未注射角叉菜膠足跖痛閾下降的現(xiàn)象，被認(rèn)為是痛記憶發(fā)生的證據(jù)[15]，因此本研究主要觀察了各組大鼠二次未造模側(cè)足跖痛閾的變化情況。

2.電針早期干預(yù)與吲哚美辛對(duì)痛記憶模型大鼠PWTs的干預(yù)效應(yīng)比較

電針和吲哚美辛于首次造模后干預(yù)如圖2所示，圖中可見(jiàn)Model組、EA1組及Indo1組大鼠兩次造模前后雙側(cè)足跖的痛閾變化。如圖2A所示，與模型組相比，EA1組及Indo1組大鼠在首次造模后3～5 d造模側(cè)（左側(cè)）足跖痛閾明顯上升(P< 0.05)，未造模側(cè)無(wú)明顯差異。二次造模前各組大鼠痛閾恢復(fù)至正常值，如圖2C所示，與Model組相比，EA1組大鼠未造模側(cè)（左側(cè)）足跖痛閾在1～3 d明顯增高(P< 0.05)；Indo1組大鼠未造模側(cè)足跖痛閾僅于1 d有明顯增高(P< 0.05)。與Indo1組相比，EA1組大鼠未造模側(cè)足跖在2 ～3 d痛閾明顯增高(P< 0.05)。

圖1 各組大鼠首次及二次造模前后雙側(cè)足跖PWTs的變化(x±SEM)與Control組相比，*P < 0.05Fig.1 The changes of bilateral PWTs before and after the first or secondary injection of all groups (x±SEM)*P < 0.05，compared Control group.

3.電針后期干預(yù)與吲哚美辛對(duì)痛記憶模型大鼠PWTs的干預(yù)效應(yīng)比較

電針和吲哚美辛于二次造模后干預(yù)如圖3所示，圖中可見(jiàn)Model組、EA1組及Indo1組大鼠二次造模前后未造模側(cè)（左側(cè)）足跖的痛閾變化。從圖3A及圖3B中可看出，各組大鼠在首次造模前后雙側(cè)足跖痛閾均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P> 0.05）。14 d后大鼠足跖痛閾恢復(fù)至基礎(chǔ)水平，進(jìn)行二次造模。從圖3C中可看出，與Model組及Indo2組相比，EA2組大鼠未注射側(cè)（左側(cè)）足跖痛閾在2～3 d均有明顯增高（P< 0.05）；圖3D中，與Model組相比，EA2組和Indo2組大鼠注射側(cè)（右側(cè)）足跖痛閾在1～3 d均明顯增高（P< 0.05）。

3.不同時(shí)間電針介入對(duì)痛記憶模型大鼠機(jī)械痛閾的干預(yù)效應(yīng)比較

圖4為電針在首次及二次造模后介入對(duì)痛記憶模型大鼠未造模側(cè)（左側(cè)）足跖痛閾的影響。如圖所示，二次造模前各組大鼠基礎(chǔ)痛閾均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。造模后與EA2組相比，EA1組大鼠未造模側(cè)（左側(cè)）足跖痛閾在2～3 d有明顯增高（P< 0.05）。

討 論

Igor Kissin等人在2006年建立的角叉菜膠足跖二次交叉注射痛記憶模型，由于大鼠造模后的行為學(xué)表現(xiàn)與人類炎性疼痛表現(xiàn)相似，被廣泛應(yīng)用于痛記憶的研究中。痛記憶的形成機(jī)制可能與大腦中樞的疼痛信息傳輸與儲(chǔ)存相關(guān)[16]。當(dāng)機(jī)體曾經(jīng)經(jīng)歷的痛苦或不愉快情緒及其他相關(guān)的疼痛信息傳輸至大腦中樞并儲(chǔ)存于記憶中，當(dāng)類似情景再次發(fā)生便會(huì)再次喚醒痛記憶并引發(fā)逃避厭惡的現(xiàn)象[17,18]。近期有研究表明[19,20]，小鼠腦中存在多種類型的記憶，并且這些記憶可能發(fā)生重疊，其中不愉快的部分則會(huì)影響行為表現(xiàn)。因此，如何有效擦除痛記憶痕跡以及其相關(guān)機(jī)制研究顯得尤為必要[21,22]。本次實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了“痛記憶”模型，14 d后Model組二次造模，未注射側(cè)足跖痛閾明顯下降，提示造模成功，痛記憶被喚醒。

圖2 不同療法早期干預(yù)對(duì)模型大鼠痛記憶的影響(x±SEM)與Model組相比，#P < 0.05; 與Indo1組相比，*P < 0.05Fig.2 The effects of early intervention on pain memory of the model rats (x±SEM)#P < 0.05, compared with Model group; *P < 0.05, compared with Indo1 group.

電針應(yīng)用廣泛且鎮(zhèn)痛效果明顯有效，其在疾病發(fā)生發(fā)展的不同時(shí)段介入也會(huì)產(chǎn)生不同的效應(yīng)。電針參與下行抑制通路，將大腦中的化學(xué)物質(zhì)傳輸至脊髓細(xì)胞中，阻礙疼痛受體產(chǎn)生的疼痛信號(hào)從而達(dá)到鎮(zhèn)痛效果[23]。之前有研究表明，電針的早期干預(yù)可以有效緩解大鼠痛記憶現(xiàn)象的喚醒，其機(jī)制可能與脊髓背角 (spinal cord dorsal horn, SCDH) 星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)[24]。電針可能影響神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放，例如腦源性營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞型營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)等，進(jìn)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[25]。此外有研究證明，重復(fù)電針可明顯改善慢性痛大鼠的痛感覺(jué)及痛情緒，其機(jī)制可能與大鼠杏仁核GluA1蛋白相關(guān)[26]。而早期干預(yù)與痛記憶形成后再干預(yù)之間的鎮(zhèn)痛效應(yīng)差異鮮有研究。本實(shí)驗(yàn)在痛記憶模型大鼠一次造模和二次造模各時(shí)段介入電針治療，首次造模時(shí)介入的EA1組大鼠注射側(cè)痛閾明顯上升，且在二次造模痛記憶喚醒后，大鼠未注射側(cè)足跖仍然明顯高于Control組。此外，與EA2組相比，EA1組在首次造模與痛記憶喚醒后的痛閾也明顯增高。提示電針的介入能有效阻斷痛記憶現(xiàn)象的喚醒，且早期干預(yù)比痛記憶形成之后再介入治療更具有效性。NSAIDs的消炎、鎮(zhèn)痛以及解熱作用明確且廣泛應(yīng)用于多種急慢性疼痛甚至癌性痛中[27]，但副作用不容忽視[28,29]，這使得對(duì)針灸的研究顯得更為必要，便于為臨床提供更優(yōu)質(zhì)的治療方式。實(shí)驗(yàn)中，我們采用吲哚美辛灌胃的方式與電針組進(jìn)行比較，結(jié)果提示首次造模時(shí)介入的Indo1組大鼠注射側(cè)足跖痛閾較Model組明顯升高，而痛記憶形成后，其痛閾并無(wú)明顯變化。這表明NSAIDs能有效緩解疼痛現(xiàn)象，但對(duì)痛記憶的喚醒并沒(méi)有明顯阻斷效應(yīng)。

圖3 不同療法后期干預(yù)對(duì)模型大鼠痛記憶的影響(x±SEM)與Model組相比，#P < 0.05; 與Indo1組相比，*P < 0.05Fig.3 The effects of later intervention on pain memory of the model rats (x±SEM)#P < 0.05，compared with Model group; *P < 0.05，compared with Indo1 group.

圖4 不同時(shí)間電針干預(yù)對(duì)模型大鼠痛記憶的影響(x±SEM)與EA2組相比，*P < 0.05Fig.4 The effect of EA at different intervention time on pain memory of the Model rats (x±SEM)*P < 0.05, compared with EA2 group.

本研究結(jié)果揭示了電針對(duì)痛記憶有抑制作用，且早期干預(yù)優(yōu)于晚期干預(yù)，這為臨床應(yīng)用針灸治療疼痛類疾病提供良好的理論研究基礎(chǔ)。常用NSAIDs對(duì)痛記憶無(wú)明顯干預(yù)效應(yīng)，提示電針和NSAIDs雖可能均有相似鎮(zhèn)痛機(jī)制，但對(duì)痛記憶的干預(yù)作用不盡相同。

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