仲偉潭,宋盼,彭亮,郭月玲,王崔巖,張雪霞

(微生物藥物國(guó)家工程研究中心、河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心、華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050015)

桿菌肽是多肽類抗生素，1943年被美國(guó)Johnson第一次發(fā)現(xiàn)，可以從枯草桿菌和地衣芽胞桿菌發(fā)酵液中提取分離制得[1]。桿菌肽由12個(gè)氨基酸組成[2]，含有A、B、C、D、E、F、G等至少9種組分，其中，桿菌肽A為主要活性組分[3]，桿菌肽A在堿性條件下可自發(fā)氧化，形成沒(méi)有抗菌活性的桿菌肽F組分[4]。桿菌肽的抗菌譜與青霉素相似，主要用于治療耐青霉素的葡萄球菌感染[5]。由于其副作用大，在臨床上主要是外用，廣泛用于治療深部真菌、皮膚[6]和黏膜真菌等疾病。桿菌肽還是一個(gè)重要的飼料添加劑，5×10-6～100×10-6濃度可促進(jìn)家禽和牲畜對(duì)食物的利用以增重[4]。

目前，對(duì)于桿菌肽的提取分離方法[7]以及分析檢測(cè)方法[8-10]的報(bào)道已經(jīng)不少，但是對(duì)于分離制備桿菌肽各組分的報(bào)道極少，并且工藝復(fù)雜。本文運(yùn)用制備型高壓液相色譜技術(shù)，優(yōu)化工藝條件，分離制備出了桿菌肽組分A、B1、B2、B3、C1、C2、C3，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，為桿菌肽的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

圖1 桿菌肽各組分的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 桿菌肽粗粉，華北制藥新藥研發(fā)中心自制；HZ816大孔吸附樹(shù)脂，上海華震科技有限公司；甲醇(制備級(jí))，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司；乙醇(工業(yè)級(jí))，滄州興隆化工有限公司；甲醇(色譜級(jí))，美國(guó)Merck公司；乙腈(色譜級(jí))，美國(guó)Merck公司；去離子水，華北制藥新藥研發(fā)中心自制；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。高壓液相制備色譜儀，漢邦科技有限責(zé)任公司；LA-2010A型高效液相色譜儀，島津公司；凍干機(jī)，德國(guó)Martin Christ公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海榮生化儀器廠；pH計(jì)，梅特勒·托利多實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)FE20；Nicolet Magna-IR 550型傅立葉紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet公司；TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；INVOA 500型核磁共振波譜儀，美國(guó)Varian公司；ZMD Micromass型質(zhì)譜儀，美國(guó)Micromass公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 (1)分析色譜條件。分析型色譜柱：納微Unisil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為甲醇；B為1.54‰乙酸銨水溶液(乙酸調(diào)pH至5.0)-乙腈(9∶1，V/V)；A∶B=53∶47；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；分析時(shí)間：40 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。(2)高壓液相制備色譜條件。制備型色譜柱：納微Unisil C18色譜柱(30 mm×250 mm，10 μm)；流動(dòng)相：A為甲醇(制備級(jí))；B為1.54‰乙酸銨水溶液[(乙酸調(diào)節(jié)pH至5.0)-乙腈=(9∶1，V/V)]；A∶B=9.0∶11.0；總流速：40 mL·min-1；上樣量：200 mg；分析時(shí)間：60 min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

1.2.2 桿菌肽粗粉的純化 稱取130 g桿菌肽粗粉用300 mL去離子水溶解，注入4LHZ816吸附樹(shù)脂柱，流速60 mL·min-1，棄去柱流出液。吸附完成后，用3BV(BV：樹(shù)脂柱床體積)30%乙醇溶液洗滌，棄去柱流出液。再以4BV 60%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液。將洗脫液中的乙醇經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收后，濃縮液冷凍干燥，得42 g桿菌肽樣品。

1.2.3 桿菌肽各組分的制備 稱取桿菌肽樣品2.0 g，加入20 mL流動(dòng)相溶解，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，注入分析型高壓液相色譜儀，根據(jù)色譜圖分別收集各組分流出液[8]。分別合并分析型高壓液相色譜儀檢測(cè)后單個(gè)組分含量高于90%的桿菌肽組分收集液，45 ℃真空濃縮，除去甲醇(回收)后，上HZ816樹(shù)脂柱吸附，水洗，60%乙醇解析，解析液濃縮至桿菌肽組分大約60 g·L-1，冷凍干燥，得桿菌肽組分凍干粉。

2 結(jié)果

2.1 高壓液相制備色譜條件的確立 由于桿菌肽組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式中有大量的酰胺鍵(酰胺基)、羧基、氨基等，分子極性較大；從電荷性質(zhì)看，單個(gè)分子中含有兩個(gè)游離羧基、兩個(gè)游離氨基、兩個(gè)含氮唑環(huán)，整體偏堿性更多一些，在這個(gè)基礎(chǔ)上選用納微Unisil C18反相色譜柱進(jìn)行分離制備，檢測(cè)波長(zhǎng)選定為254 nm。根據(jù)參考文獻(xiàn)[11-12]，最終對(duì)制備色譜條件的流動(dòng)相配比、pH值、上樣量等因素進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 流動(dòng)相pH的確立 由于桿菌肽A在堿性條件下可自發(fā)氧化，形成沒(méi)有抗菌活性的桿菌肽F，所以選用了偏酸性的pH進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。從制備色譜圖上看，見(jiàn)圖2，pH為5.0時(shí)分離效果比較好，從高壓液相色譜儀檢測(cè)結(jié)果看，在此pH值各組分的收集液純度均達(dá)到95%以上，因此選用pH值5.0制備桿菌肽各組分，見(jiàn)表1。

圖2 不同pH的流動(dòng)相下桿菌肽各組分的高壓液相色譜圖

桿菌肽組分R1R2R3A-CH3-CH3-CH3B1-H-CH3-CH3B2-CH3-H-CH3B3-CH3-CH3-HC1-H-H-CH3C2-H-CH3-HC3-CH3-H-H

表2 不同pH的流動(dòng)相制備桿菌肽各組分的HPLC結(jié)果

2.1.2 流動(dòng)相配比的確立 不同的流動(dòng)相配比對(duì)分離度和柱壓都有一定的影響，因此本實(shí)驗(yàn)分別考察了A∶B=8.0∶12.0、A∶B=9.0∶11.0、A∶B=10.0∶10.0、A∶B=11.0∶9.0配比下桿菌肽各組分的分離情況，結(jié)果表明：A比例越高，各組分出峰越快，可以縮短制備周期，但是A比例過(guò)高，分離度明顯下降，以至于不能收集到高純度的C3組分，適當(dāng)降低A比例，有利于提高分離度，使各組分有效分離，但A比例太低，柱壓會(huì)升高，各組分出峰時(shí)間會(huì)延遲。綜合考慮，選擇A∶B=9.0∶11.0為最佳流動(dòng)相配比。

2.1.3 上樣量的確立 由于桿菌肽樣品中各雜質(zhì)組分含量較低，尤其是C3組分含量?jī)H有5%左右，上樣量太小，影響制備量，制備周期延長(zhǎng)，耗時(shí)耗材，因此分別考察上樣量為100、150、200、250 mg的分離效果，以收集到的C3組分純度為指標(biāo)，結(jié)果表明，上樣量太大，分離度明顯下降，收集不到高純度的C3組分。為了避免載樣過(guò)量，保證一定的分離度，以及避免樣品可能在柱子頂部沉積，對(duì)柱子造成損害，綜合考慮，確定上樣量為200 mg。

2.2 樣品檢測(cè) 冷凍干燥制得的桿菌肽各組分，經(jīng)分析型高壓液相色譜儀測(cè)定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組分色譜圖基本為單一色譜峰，如圖3所示，采用面積歸一化法計(jì)算，純度均在95%以上。制得的各組分紅外光譜測(cè)定數(shù)據(jù)與其分子中功能團(tuán)所應(yīng)具有的紅外吸收峰一致(見(jiàn)表3)。在水溶液中，經(jīng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定，制得的各組分最大吸收波長(zhǎng)為251 nm，與桿菌肽各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)應(yīng)表現(xiàn)的性質(zhì)一致。經(jīng)質(zhì)譜儀和核磁共振波譜儀對(duì)各組分進(jìn)行波譜分析和結(jié)構(gòu)鑒定，所得數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。

表3 桿菌肽各組分紅外(IR)吸收峰及其歸屬

圖3 桿菌肽原粉及各組分的HPLC色譜圖

3 討論

桿菌肽是一種多組分的多肽類抗生素，在發(fā)酵產(chǎn)物中A和B的含量總和在96%左右，其它組分含量很低。要分離制備出桿菌肽的各組分，難度很大，目前相關(guān)方面的報(bào)道極少，并且工藝復(fù)雜。本文主要介紹用制備型高壓液相色譜儀分離制備出桿菌肽A、B1、B2、B3、C1、C2、C3等7個(gè)組分的方法(7個(gè)組分的詳細(xì)分析數(shù)據(jù)和譜圖將另文發(fā)表)，產(chǎn)品純度均在95%以上。此方法操作簡(jiǎn)單，所用有機(jī)溶劑可回收，對(duì)環(huán)境污染小，為桿菌肽的分離純化奠定了基礎(chǔ)。

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