張華妮，李文芳，朱少銘，鄭金紅

(1.武漢科技大學醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，湖北 武漢 430065；2.十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，湖北 十堰 442000)

盆腔炎是指女性內(nèi)生殖器，包括子宮、卵巢、輸卵管及其周圍的結(jié)締組織、盆腔腹膜發(fā)生的炎癥，已婚女職工中發(fā)病率為0.25%[1]，有急性與慢性之分。慢性盆腔炎臨床以下腹墜脹疼痛、月經(jīng)異常、異位妊娠為特點，該病有44.4%出現(xiàn)不孕癥[2]。近年不孕率逐漸升高，加劇年出生人口減少，因此尋找療效好且副作用小的盆腔炎治療藥物對提高女性生殖健康和延緩人口老齡化進程有重要意義。盆腔炎的傳統(tǒng)治療以內(nèi)服中藥為主，隨著醫(yī)療技術(shù)的進步，中藥保留灌腸外治法日益受到廣大醫(yī)護和患者喜愛，應用范圍也從婦科疾病擴大到直腸炎、腸梗阻、慢性腎衰竭、肝膽疾病等。盆腔炎灌腸合劑是十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院總結(jié)多年臨床治療經(jīng)驗，由野菊花、蒲公英、紫花地丁、紅花等10味中藥加工而成的灌腸用合劑，有清熱解毒、活血化瘀、消腫散結(jié)功效，現(xiàn)用于治療慢性盆腔炎、宮頸癌放射性腸炎、子宮內(nèi)膜異位癥、不孕癥、異位妊娠等疾病，應用多年，患者普遍反映效果滿意。一直以來，該合劑的生產(chǎn)過程依靠藥工經(jīng)驗把握，質(zhì)量穩(wěn)定性和均一性欠佳，為建立一套規(guī)范化的生產(chǎn)工藝，穩(wěn)定制劑質(zhì)量，筆者建立了一種適用于基層醫(yī)院快速測定盆腔炎灌腸合劑總酚酸和收膏率的方法，用正交實驗法篩選出最佳水提取生產(chǎn)工藝，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 儀器與設備 UV2401 紫外分光光度計(日本島津公司)；SQP型電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵(河南宇科自動化儀器儀表設備有限公司)；GZX-GF101-2-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥箱(上海賀德實驗設備有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市天竟實驗儀器廠)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；ZNHW-∥智能恒溫電熱套(金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.2 試劑與材料 綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110753-200413)，處方：當歸(批號146220，產(chǎn)地甘肅)、赤芍(批號140305，產(chǎn)地黑龍江)、黃柏(批號140302，產(chǎn)地吉林)飲片均購自亳州市宏宇中藥飲片有限公司。紅花(批號20151001，產(chǎn)地新疆)、蒲公英(批號20151201，產(chǎn)地湖北)和桃仁(批號20160101，產(chǎn)地湖北)飲片均購自十堰宏康中藥材有限公司。牡丹皮(批號141201，產(chǎn)地安徽)和雞血藤(批號140401，產(chǎn)地湖北)飲片購自湖北清大中藥飲片有限公司。紫花地丁(批號20150501，產(chǎn)地湖北)和野菊花(批號20150901，產(chǎn)地湖北)飲片均購自湖北神農(nóng)本草中藥飲片有限公司，甲醇、乙醇為分析純，蒸餾水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方與工藝流程 (1)處方：當歸100 g、赤芍100 g、牡丹皮100 g、桃仁100 g、紅花150 g、雞血藤150 g、黃柏150 g、蒲公英150 g、野菊花150 g、紫花地丁150 g;(2)處方分析：本方劑是在桃紅四物湯基礎(chǔ)上加減。將上述藥材加12倍冷水浸泡2 h，大火燒開，小火煮1 h，過濾；二煎加入3倍冷水，大火燒開，小火煮1 h，過濾；合并2次過濾液，濃縮成清膏，相對密度ρ=1.10～1.18(60 ℃)，過濾，分裝為每瓶100 mL，密封，121 ℃滅菌15 min，1～3 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 檢測方法

2.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取綠原酸對照品6.5 mg，甲醇定容至10 mL，配成650 mg·L-1的濃溶液，分別吸取適量對照品溶液，置于100 mL容量瓶，用蒸餾水定容，混勻，配成濃度分別為3.25、6.50、9.75、13.00、19.50、26.00 mg·L-1的綠原酸溶液，此為標準系列溶液。將標準溶液在270～370 nm波長范圍掃描測定綠原酸的最大吸收波長，在最大波長處測定吸光度。以綠原酸對照品的濃度(mg·L-1)為橫坐標、以其吸光度為縱坐標繪制標準曲線，求出相應的回歸方程。對綠原酸標準溶液的波長掃描結(jié)果顯示，綠原酸最大吸收波長在326～327 nm，參考文獻[3]，選定測定波長為326 nm。標準曲線結(jié)果表明，綠原酸濃度在3.25～26.00 mg·L-1范圍內(nèi)綠原酸與其吸光度值呈良好的線性關(guān)系，線性方程為A=0.046 19C-0.052 34，r=0.997 2，結(jié)果見圖1。

圖1 綠原酸標準曲線

2.2.2 收膏率的測定 按處方比例稱取藥材，按照正交實驗條件提取樣品，取各工藝提取物1 000 mL，加熱回流后濃縮至相對密度為1.13(60 ℃)。精密稱取總濾液20%至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后移至烘箱中，于105 ℃干燥至恒重N。同時按照處方比例稱取飲片，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，于105 ℃干燥5 h，稱定重量，繼續(xù)干燥1 h，稱重，直至恒重M。以干燥品計算收膏率。

2.2.3 總酚酸含量的測定 (1)綠原酸對照品的制備：精密稱取綠原酸對照品適量，置1 000 mL的容量瓶中，加適量的甲醇溶解后，加水至刻度，搖勻，即得；(2)供試品溶液的制備：精密量取樣品溶液1 mL，置于1 000 mL量瓶中，在326 nm測定吸光度，計算灌腸劑中總酚酸含量。

2.3 單因素試驗設計(預試驗) 查閱相關(guān)文獻[4]，為方便實際應用，同時考慮到溫度過高影響藥材的穩(wěn)定性，會造成有效成分降低，考察料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14)，提取次數(shù)(1、2、3次)， 提取時間(1、1.5、2、2.5、3 h)等條件對實驗結(jié)果的影響。取各藥材適量，精密稱定，按實驗設計，加入不同倍數(shù)的水，浸泡1 h后，加熱提取，冷卻去渣，提取液濾過后，定容至適當體積，采用收膏率和總酚酸含量作為對單因素試驗設計結(jié)果的考察指標。

2.3.1 料液比對提取結(jié)果的影響 料液比實驗結(jié)果表明，隨著加水量的增加，收膏率和總酚酸提取率也隨著增加，見圖2。

圖2 料液比對結(jié)果的影響

2.3.2 提取時間對提取結(jié)果的影響 不同提取時間實驗結(jié)果表明：隨著提取時間的增加，收膏率和總酚酸提取率先增加，后隨著提取時間增加而減少，在1.5 h時達到最大，見圖3。

圖3 提取時間對結(jié)果的影響

2.3.3 提取次數(shù)對提取結(jié)果的影響 不同提取次數(shù)實驗結(jié)果表明：提取次數(shù)增加，總酚酸含量也隨著增加，后隨著提取次數(shù)繼續(xù)增加含量變化不大；收膏率隨著提取次數(shù)的增加而增大，見圖4。

圖4 提取次數(shù)對結(jié)果的影響

2.4 正交實驗設計 參考文獻[5]，根據(jù)單因素預實驗結(jié)果，選擇煎煮料液比、煎煮次數(shù)、煎煮時間作為考察因素，每個因素選擇三個水平，進行三因素三水平正交實驗L9(34)，以干燥品計算收膏率和總酚酸含量，采用收膏率和總酚酸含量作為提取工藝評價的指標。正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表

2.5 最佳工藝確定 以綜合評分法對實驗結(jié)果進行直觀分析和方差分析，綜合評分=總酚酸含量評分+收膏率含量評分；總酚酸含量評分=(總酚酸含量/最大總酚酸含量)×0.6；收膏率評分=(收膏率/最大收膏率)×0.4。結(jié)果見表2和表3。用Excel和正交設計助手Ⅱv3.1分析表明，提取次數(shù)對實驗結(jié)果影響差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而提取時間和料液比影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。從表2中R值可知各因素對結(jié)果的影響高低程度為提取次數(shù)>料液比>提取時間。

方差分析顯示，提取次數(shù)是本次實驗的主要因素，考慮到酚酸成分受熱時間過長，提取次數(shù)過多，會導致部分總酚酸的損失[6]，且增加能源成本，結(jié)合傳統(tǒng)煎藥方法，將提取次數(shù)定為2次。料液比是影響實驗結(jié)果的重要因素之一，考慮到料液比在1∶12和1∶14間差異無統(tǒng)計學意義，從整體考慮，將料液比定為1∶12。因提取時間對結(jié)果影響不顯著，選擇時間為1 h，根據(jù)以上實驗結(jié)果，選擇較佳工藝為A2B1C2。

表2 盆腔炎灌腸合劑的提取實驗

表3 正交實驗方差結(jié)果分析

注：aP<0.05表明此因素對提取工藝結(jié)果影響顯著。

3 討論

酚酸成分廣泛存在于藥用植物中，比如丹參中的丹酚酸、金銀花中的綠原酸和異綠原酸、當歸中的阿魏酸等。酚酸類成分有抗菌[7]、清除自由基、抗炎[8]、抗腫瘤[9]、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。由相關(guān)文獻[10-11]知，試驗中使用的藥材桃仁、紅花、當歸、川芎、蒲公英等亦含酚酸類物質(zhì)，如綠原酸、阿魏酸、咖啡酸、香莢蘭酸等，故選總酚酸為測定指標之一。

綠原酸是盆腔炎灌腸合劑中野菊花、蒲公英[12]、紫花地丁[13]、黃柏[14]、紅花[10]等中藥共同含有的一種酚酸類活性成分，可用紫外分光光度法、高效液相色譜法等多種方法檢測，研究者[15]以綠原酸為對照，建立了抗菌消炎片、抗感冒沖劑等成藥中總酚酸的含量分析方法，完善了中藥的質(zhì)量標準。盆腔炎灌腸合劑藥物達10味，成份構(gòu)成復雜且含量較低，其臨床療效體現(xiàn)在復方配伍的綜合作用和整體效應上，故選擇收膏率、總酚酸含量兩個指標進行綜合選取提取工藝。本試驗以綠原酸做參照，測定了盆腔炎灌腸合劑中總酚酸的含量，結(jié)果表明，方法可行，穩(wěn)定。

臨床采用中藥灌腸治療盆腔炎的報道很多，本方是醫(yī)院多年經(jīng)驗處方，臨床效果確切，副作用輕微，并被廣大患者接受，本方欲開發(fā)成一種符合醫(yī)院制劑的中藥灌腸劑，更適合臨床推廣。

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