曹廣超,王彥多,劉 穎,李亞男,劉金虎,桑 曉,毛會(huì)秀,王集會(huì),史 磊*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

蜣螂是鞘翅目金龜子科昆蟲屎殼螂Catharsius molssus L.的干燥全蟲[1]，在我國藥用歷史悠久，蜣螂作為傳統(tǒng)中藥材，其體內(nèi)含有蜣螂毒素，能破癥結(jié)，通二便，定驚癇﹑拔毒生肌﹑散腫止血[2]。臨床上在治療小兒厭食癥，粘連性腸梗阻，輸尿管結(jié)石，肝硬化腹水方面臨床效果稱奇[3]?，F(xiàn)在藥理學(xué)對(duì)蜣螂的研究，主要集中于抗前列腺炎、抗前列腺增生以及抗炎等的方面[4-6]，而在其療效好抗腫瘤方面的研究相對(duì)較少。僅在黃顯章等對(duì)蜣螂的醇提取物進(jìn)行人體肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，蜣螂對(duì)肝癌的抑制作用有顯著的效果[7]。

本次實(shí)驗(yàn)，我們采用優(yōu)化后的提取工藝提取發(fā)酵蜣螂醇提物，旋蒸后得發(fā)酵蜣螂的乙醇提取物，選擇有代表性的腫瘤細(xì)胞如乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、肺腺癌細(xì)胞(A549)進(jìn)行體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)。為蜣螂在臨床上的應(yīng)用及發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤藥物提供新的研究思路。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV9100B型紫外可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)；ST 16R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)；DLSB-ZC低溫循環(huán)真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；FA1004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);六兩裝高速萬能粉碎機(jī)(浙江屹立工貿(mào)有限公司);遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱(上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；EL340i型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Molecular Davices);Memmert CO2培養(yǎng)箱(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試劑

蕓香葉苷 三水(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20170426);RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(賽默飛世爾生物制品北京有限公司)；MTT。

1.3 供試品

藥材蜣螂購自安徽省亳州市中藥材市場(chǎng), 經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定為蜣螂蟲Catharsius molossus L.的干燥體(批號(hào)：20170502)。

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

肺腺癌A549細(xì)胞株、乳腺癌MCF-7細(xì)胞株均由山東省立醫(yī)院提供。

2 方法

2.1 藥材前期處理

將蜣螂經(jīng)清水漂洗后瀝干，放入冷凍室冷凍后勻漿，在冷阱-60℃，室溫真空狀態(tài)下冷凍干燥至粉末狀，得蜣螂凍干粉。

2.2 發(fā)酵蜣螂粉的制備[8]

稱取適量的蜣螂凍干粉，按1∶1比例加入活的白僵菌孢子粉(100億/g，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自篩菌株-桃5)，再加入少量吐溫-80，用適量滅菌水將其稀釋成1×108的混懸液，攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移至恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，在溫度為25～28 ℃，濕度為95 %的條件下發(fā)酵8h左右，直到長滿菌絲后便停止發(fā)酵，將其取出冷凍保存，以作備用。

2.3 發(fā)酵蜣螂乙醇提取物的制備[9]

稱取蜣螂凍干粉1.0000 g，加入圓底燒瓶中，按料液比1∶20加入80%的乙醇，在90℃條件下，乙醇回流提取兩次共2.5 h，抽濾后3000 r/min下離心10 min，最后將上清液(發(fā)酵蜣螂乙醇提取液)置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙醇, 即得蜣螂乙醇提取物。取出裝袋冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 發(fā)酵蜣螂醇提物抗腫瘤活性研究

2.4.1 發(fā)酵蜣螂乙醇提物溶液的配制

精密稱取10 mg發(fā)酵蜣螂乙醇提物，溶于5 mL 1640培養(yǎng)液中，配成2 mg/mL溶液。在超凈工作臺(tái)中用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾，然后用已濾菌的1640培養(yǎng)基依次稀釋，配成1.6、1.2、0.8、0.4mg/mL濃度梯度的藥物溶液。

2.4.2 抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)方法

將處于對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌MFC-7細(xì)胞和肺腺癌A549，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，預(yù)留三個(gè)調(diào)零孔(調(diào)零孔只加不含血清的1640培養(yǎng)基，不加細(xì)胞)置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待96孔板中的細(xì)胞長滿單層后，棄掉培養(yǎng)基，調(diào)零組和空白對(duì)照組加100 μL的1640培養(yǎng)基(不含血清)，陽性對(duì)照組加100 μg/mL的順鉑100μL，其他給藥組每孔分別加入不同濃度的藥物100 μL，每個(gè)濃度的藥物重復(fù)5個(gè)孔，其中以發(fā)酵蜣螂醇提液作為對(duì)照組。然后繼續(xù)在37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，每孔加入5 mg/Ml MTT溶液20 μL于培養(yǎng)箱內(nèi)避光反應(yīng)4 h。吸去上清液，加入100 μL DMSO，用酶標(biāo)儀于492 nm處測(cè)定吸光度值，然后按下式進(jìn)行藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率的計(jì)算。

細(xì)胞抑制率(%)=[1-(加藥組OD-調(diào)零組)/(空白組OD-調(diào)零組)]×100 %

3 結(jié)果

3.1 MTT法測(cè)定發(fā)酵蜣螂乙醇提取物抗腫瘤活性

采用MTT法檢測(cè)不同濃度梯度下發(fā)酵蜣螂乙醇提取物對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549、乳腺癌細(xì)胞MFC-7的抑制作用如表1所示。

組別A549細(xì)胞MCF-7細(xì)胞A492抑制率/%A492抑制率/%陰性對(duì)照0．361+0．001-0．317+0．001-發(fā)酵蜣螂乙醇提取物/(mg·L-1)0．40．250+0．00137．940．301+0．0016．210．80．263+0．00133．310．287+0．002b11．471．20．216+0．00149．580．220+0．00138．021．60．160+0．002a68．820．217+0．00139．122．00．146+0．002b73．730．111+0．00180．75

與陰性對(duì)照組比較，a：P<0.05，b:P<0.01。

為方便將不同濃度梯度下發(fā)酵蜣螂乙醇提取物對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549、乳腺癌細(xì)胞MFC-7的抑制作用進(jìn)行顯著比較及趨勢(shì)分析，列數(shù)據(jù)抑制率曲線如圖1所示。橫坐標(biāo)為不同藥物的濃度(mg/mL)，縱坐標(biāo)為醇提液對(duì)A549和MCF-7的抑制率(%)。

圖1 發(fā)酵蜣螂乙醇提取物對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549、乳腺癌細(xì)胞MFC-7的抑制率
Fig.1 Inhibition ratio of the fermented Catharsius powders alcohol extracts on lung adenocarcinoma A549 and breast cancer MFC-7 cell

由圖1可知，不同藥物濃度對(duì)乳腺癌MCF-7和肺腺癌A549細(xì)胞具有較好的抑制作用，其IC50分別為1.51和0.94 mg/mL。隨藥物濃度的增加，對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制率成梯度性上升，且在藥物濃度小于1.6 mg/mL，其抑制效果不太顯著；當(dāng)藥物濃度低于1.2 mg/mL時(shí)，對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制率較弱，其后抑制效果隨濃度的增加而增大。總體來說，在藥物濃度低于1.6 mg/mL時(shí)，藥物對(duì)肺腺癌細(xì)胞的抑制率比對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用強(qiáng)，但作用強(qiáng)度較小。當(dāng)藥物濃度超過1.6mg/mL時(shí)，對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞和乳腺癌MCF-7具有很強(qiáng)的抑制效果，且作用強(qiáng)度后者大于前者。

4 討論

蟲類中藥的發(fā)酵，在國內(nèi)外研究報(bào)道鮮少，采用新型固態(tài)發(fā)酵技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)中藥進(jìn)行成分提取，也是對(duì)蟲類中藥研究的的重大變革。中藥炮制就運(yùn)用天然微生物發(fā)酵傳統(tǒng)中藥，有的可以提高中藥藥效，改變藥性及降低毒副作用等效應(yīng)。本次研究中使用球孢白僵菌對(duì)蜣螂粉進(jìn)行真菌發(fā)酵,研究經(jīng)發(fā)酵后蜣螂醇提物的藥理活性，以期為蜣螂抗腫瘤新藥物成分的提取，提供新的方法，其次也增強(qiáng)藥物治療效果。在發(fā)酵蟲類中藥的研究中，具有一定的前瞻性。

體外藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：通過采用新型固體發(fā)酵方式，有利于提高蜣螂有效成分的提出率。再經(jīng)乙醇回流提取后，對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞和乳腺癌MCF-7具有不同的抑制效果。低濃度時(shí)，抗腫瘤抑制效果較弱；當(dāng)提高藥物濃度，有利于藥物通過被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制或產(chǎn)生細(xì)胞周期阻抑，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤抑制效果?？傮w本次研究表明：發(fā)酵蜣螂醇提物對(duì)MCF-7和A549具有較好的抑制作用,且作用強(qiáng)度與藥物濃度成正比。其次為體內(nèi)蜣螂抗腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)的研究提供指導(dǎo)，有利于開發(fā)新的抗腫瘤藥物為臨床用藥提供新思路。

[1] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].2版.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2006．

[2] 侯仙明,張書金,賈云芳,等.蜣螂古今應(yīng)用研究[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2014(2):42-44.

[3] 陳建軍,劉立春.兩種藥用蜣螂蟲的人工飼養(yǎng)及誘捕技術(shù)[J].南京農(nóng)專學(xué)報(bào),2001(4):44-48.

[4] Ahn M Y，Hahn B S，Ryu K S,et al.Purification and characterization of a serine protease: (CPM-2) with fbrinolytic activity from thedung beetles[J].Arch Pharm Res,2005,28(7):816-822．

[5] 趙興梅,朱 敏,楊 明,等.蜣螂抗實(shí)驗(yàn)性前列腺增生作用研究[J].中藥藥理與臨床,2006(5):37-38.

[6] 劉純益.關(guān)于昆蟲抗癌物質(zhì)的研究概況[J].昆蟲知識(shí),1979(4):182

[7] 黃顯章,丁生晨,袁 林,王 旭,郝鵬飛,張景景.蜣螂水提取物的鎮(zhèn)痛抗炎作用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2016(09):2191-2194.

[8] 焦方文,張盼盼,孫 靜,等. 全蝎蛋白的超聲提取工藝研究[J/OL]. 山東中醫(yī)雜志,2016,35(09):824-825.

[9] 黃顯章,丁生晨,袁 林,等. 蜣螂乙醇提取物的抗炎作用研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2017(4)：1002-1004.

(本文文獻(xiàn)格式：曹廣超,王彥多,劉穎，等.發(fā)酵蜣螂粉乙醇提取物抗腫瘤活性研究[J].山東化工，2018，47(02)：22-24.)