王婷婷 原江鋒,2 汪倫記,2 張 彬,2 邱智軍,2 龔明貴,2,2 尹啟航

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2. 河南科技大學(xué)食品加工與安全國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 洛陽(yáng) 471023)

微波技術(shù)廣泛用于食品加工領(lǐng)域和微波輔助提取等方面。由于加熱快、操作簡(jiǎn)便、高效節(jié)能等特點(diǎn)，微波爐已成為眾多家庭必不可少的廚房用具。大多數(shù)食物中含有蛋白質(zhì)，所以用微波處理富含蛋白質(zhì)的食物時(shí)會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響是許多學(xué)術(shù)研究和應(yīng)用研究關(guān)注的重點(diǎn)[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有部分學(xué)者研究了微波對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和品質(zhì)的影響，Byaruhanga等[2]發(fā)現(xiàn)微波加熱高粱醇溶蛋白后使其β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加；Thostenson等[3]提出微波通過(guò)電磁場(chǎng)引起蛋白質(zhì)內(nèi)部分子間發(fā)生摩擦造成分子間共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的斷裂；胡博等[4]提出微波處理米蛋白后產(chǎn)生自由基并使米蛋白受熱分解；El-Shimi[5]發(fā)現(xiàn)微波烹飪及復(fù)熱牛肉片時(shí)，牛肉片風(fēng)味較傳統(tǒng)加熱得分更高。但上述研究著重關(guān)注微波技術(shù)的工藝參數(shù)優(yōu)化或者對(duì)微波工藝對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的初步探討，而關(guān)于不同微波條件引起蛋白質(zhì)變化及引起變化的可能機(jī)制鮮有報(bào)道，Bohr等[6]發(fā)現(xiàn)微波促使蛋白質(zhì)折疊變性不僅僅是熵驅(qū)動(dòng)的，也是扭轉(zhuǎn)力和彎曲力競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果，也就是說(shuō)微波對(duì)蛋白質(zhì)的影響存在非熱效應(yīng)。微波技術(shù)引起蛋白質(zhì)的改變是否對(duì)食品的安全性造成威脅目前仍不確定，這也是人們對(duì)采用微波爐來(lái)加熱和烹飪食物的安全性擔(dān)憂的主要原因。

食品蛋白種類多，生物學(xué)功能多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜；BSA屬于實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的簡(jiǎn)單模式蛋白，BSA的結(jié)構(gòu)和功能清晰，研究微波輻射對(duì)BSA的影響，對(duì)了解微波輻射蛋白質(zhì)的影響有一定的理論意義。本試驗(yàn)擬以模式蛋白BSA為研究對(duì)象，分析在不同微波處理?xiàng)l件下BSA自由基的生成規(guī)律及其氧化特性的變化，了解微波不同條件對(duì)BSA的影響，以期為微波處理富含蛋白質(zhì)食物時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)特性的可能影響提供參考，為微波技術(shù)應(yīng)用于食品加工中食品的安全性和食物品質(zhì)的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

BSA：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

DMPO：純度≥98%，美國(guó)Sigma公司；

L-亮氨酸、鄰苯二甲醛、十二烷基硫酸鈉、硼砂、β-巰基乙醇、鹽酸胍、乙醇、乙酸乙酯、三氯乙酸、鹽酸、2,4-二硝基苯肼、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水乙醇、5,5′-二硫代雙、8-苯胺-1-萘磺酸：分析純；

其他常規(guī)試劑：AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室微波合成儀：XH-MC-1型，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；

熒光光譜儀：RF-5301PC型，日本島津公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV765型，上海儀電分析儀器有限公司；

電子順磁共振波譜儀：JES-FA200型，日本JEOL公司；

低溫冷卻液循環(huán)泵：DLSB-10L型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

大扭矩調(diào)速型蠕動(dòng)泵：WT600S型，保定雷弗流體科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微波功率、微波溫度、微波時(shí)間對(duì)自由基的影響 微波儀具有加熱速度快、效率高的特點(diǎn)，但具有試驗(yàn)溫度不易控制的特點(diǎn)。為了使樣品持續(xù)性地接受微波輻射，本試驗(yàn)將加熱樣品置于密閉的外置冷循環(huán)體系中，系統(tǒng)通過(guò)溫度傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，將500 mmol/L的DMPO甲苯溶液作為自由基捕獲劑加入1 mg/mL的BSA溶液，微波頻率2 450 kHz，溫度60 ℃，時(shí)間3 min，功率分別為100，200，400，600，800 W；功率400 W，時(shí)間3 min，溫度分別為20，40，60，80，100 ℃；功率400 W，溫度60 ℃，時(shí)間分別為3，5，8 min來(lái)處理樣品；用電子順磁共振波譜儀測(cè)定不同微波功率、微波溫度、微波時(shí)間對(duì)自由基信號(hào)強(qiáng)度的影響。

1.2.2 EPR波譜檢測(cè) 自由基捕獲條件：取微波處理樣品20 μL置于EPR的共振腔中，圖譜在室溫20 ℃下測(cè)定，設(shè)置EPR中心磁場(chǎng)強(qiáng)度326 mT，掃描寬度為100 G，調(diào)制頻率86 kHz，調(diào)制幅度1 G，掃場(chǎng)時(shí)間40 s，來(lái)捕獲自由基信號(hào)。

g值根據(jù)共振式(1)[7]計(jì)算：

(1)

式中：

h——普朗克常數(shù)；

β——玻爾磁子；

v——微波頻率，GHz；

H——磁場(chǎng)，kG(1 G=0.1 mT)。

1.2.3 羰基含量的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[8]，修改如下：吸取經(jīng)功率400 W、時(shí)間3 min、溫度分別為40，60，80，90，100 ℃處理的1.0 mg/mL BSA溶液各1 mL于離心管中，每管中加入200 μL含濃度為10 mmol/L的2,4-二硝基苯肼(DNPH)的2 mol/L的HCl，對(duì)照組加入200 μL不含DNPH的2 mol/L的HCl溶液，室溫下避光反應(yīng)1 h(每隔10 min旋渦一次)，然后加入1.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的TCA，靜置10 min，混合溶液11 000 r/min離心15 min，棄上清。沉淀用體積分?jǐn)?shù)為1∶1的乙酸乙酯和乙醇的溶液1 mL洗滌，再次11 000 r/min 離心5 min，棄清液。加入2 mL的6 mol/L的鹽酸胍溶液，37 ℃下溶解沉淀20 min(每隔5 min旋渦1次)，未經(jīng)微波處理的樣品為空白對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。羰基摩爾濃度按式(2)計(jì)算：

(2)

式中：

C0——羰基的摩爾濃度，mol/g；

A——367 nm處的吸光度；

D——稀釋倍數(shù)；

C——蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；

ε——消光系數(shù)，22 000 M-1·cm-1。

1.2.4 巰基含量的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[9]，修改如下：吸取經(jīng)功率400 W、時(shí)間3 min、溫度分別為40，60，80，90，100 ℃處理的1.0 mg/mL BSA溶液1 mL，加入50 μL的5,5′-二硫代雙-2-硝基苯甲酸溶液(DTNB)(39.6 mg DTNB溶于10 mL 100 mmol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液)，再加入2 mL pH 8.0的磷酸鹽緩沖液(含有1.0 mmol/L的EDTA和1% SDS)，于25 ℃保溫60 min。412 nm處測(cè)定吸光度A，空白對(duì)照用水代替樣品。A1為有DTNB存在時(shí)樣品的吸光值，A2為無(wú)DTNB存在時(shí)樣品的吸光值，其他條件完全相同，試驗(yàn)重復(fù)3次。巰基含量按式(3)計(jì)算：

C0=73.53×(A1-A2)×D÷C，

(3)

式中：

C0——巰基的濃度，mol/g；

D——蛋白質(zhì)溶液的稀釋倍數(shù)；

C——蛋白質(zhì)溶液的濃度，mg/mL。

1.2.5 表面疏水性的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[10]，修改如下：吸取經(jīng)功率400 W、時(shí)間3 min、溫度分別為40，60，80，90，100 ℃處理的1.0 mg/mL BSA溶液，用10 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液稀釋樣品濃度在0.05～1.00 mg/mL。取樣品液2.0 mL，加入20 μL的8 mmol/L ANS溶液，震蕩，靜置3 min。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm，狹縫校正5 nm 條件下測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度，試驗(yàn)重復(fù)3次。以蛋白質(zhì)濃度對(duì)熒光強(qiáng)度作圖，BSA分子的表面疏水性指數(shù)是曲線最初階段的斜率值。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 繪圖采用Origin 2017軟件；應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波處理BSA的EPR波譜

為了鑒別微波處理BSA產(chǎn)生的自由基類型以及自由基信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度，分別對(duì)不同微波條件的樣品進(jìn)行EPR檢測(cè)。圖1中譜線a可見(jiàn)，僅有DMPO捕獲劑的試驗(yàn)體系幾乎沒(méi)有EPR信號(hào)，因此試驗(yàn)觀察到的自由基信號(hào)僅在BSA存在的情況下才產(chǎn)生。圖1譜線b中未經(jīng)微波處理的BSA，具有較低強(qiáng)度的自由基信號(hào)峰，可推測(cè)BSA本身含有一定數(shù)量的自由基。圖1譜線c～g表明，隨著微波功率的增強(qiáng)，自由基信號(hào)逐步增強(qiáng)，而且自由基信號(hào)峰的位置和峰形一致，表明不同微波功率處理BSA后自由基的種類沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。BSA的EPR波譜中源于碳原子的自由基信號(hào)，其g值范圍為2.004 1～2.005 4。從信號(hào)的g值范圍、線寬及線型來(lái)看，該碳自由基或者位于蛋白質(zhì)側(cè)鏈的其他碳原子上，或者位于BSA骨架的α-碳原子上[11]。

2.2 微波功率對(duì)BSA自由基強(qiáng)度的影響

以DMPO作為捕獲劑對(duì)不同功率微波條件下BSA的自由基進(jìn)行分析。由圖2可見(jiàn)，隨著微波功率的增加，BSA自由基信號(hào)強(qiáng)度也隨之增大，并且自由基信號(hào)絕對(duì)誤差也隨著微波功率的增加而增大。在低功率自由基信號(hào)弱的原因可能是低功率微波條件下電磁能轉(zhuǎn)化成熱能和化學(xué)能較低，還不足以引發(fā)大量自由基的生成；并且1.0 mg/mL BSA溶液體系中的水分對(duì)自由基具有一定的猝滅作用，因此檢測(cè)到的自由基信號(hào)較弱。高功率自由基信號(hào)強(qiáng)可能是高功率微波條件下電磁能轉(zhuǎn)化成的熱能和化學(xué)能較高，引發(fā)大量自由基的生成；且1.0 mg/mL BSA溶液體系中的水分對(duì)自由基的猝滅作用不足以使生成的較多自由基明顯降低。微波功率是一個(gè)影響微波自由基的主要因素，可以推測(cè)微波加熱富含蛋白質(zhì)食物時(shí)，為了避免微波電磁能轉(zhuǎn)化成熱能和化學(xué)能而生成的自由基對(duì)蛋白質(zhì)的氧化特性造成影響，可以選擇低于400 W來(lái)處理食物，這樣對(duì)富含蛋白質(zhì)食物的影響較小。

a. 500 mmol/L DMPO EPR譜線 b. BSA的500 mmol/L DMPO EPR譜線 c～g. BSA的500 mmol/L DMPO分別在100，200，400，600，800 W的EPR譜線

圖2 不同微波功率下BSA自由基信號(hào)強(qiáng)度Figure 2 The intensity of free radical spin adducts treated in BSA at various microwave power

2.3 微波溫度對(duì)BSA自由基強(qiáng)度的影響

如圖3所示，在BSA溶液中自由基信號(hào)強(qiáng)度在20～100 ℃ 時(shí)隨微波溫度的升高而增加，但是在超過(guò)60 ℃，自由基信號(hào)增幅變小。微波溫度對(duì)體系的影響比較復(fù)雜，因?yàn)闇囟瓤梢杂绊憵怏w溶解度、表面張力和液體蒸氣壓[12]。溫度升高，使溶液的表面張力和黏度降低，而增加了液體蒸氣壓。這可能在高溫度下DMPO/自由基不穩(wěn)定[13]，因此在超過(guò)60 ℃ 時(shí)DMPO/碳自由基沒(méi)有較大增幅，同樣Zhang等[14]也報(bào)道了DMPO誘導(dǎo)的1-羥基乙基自由基在高溫下不穩(wěn)定的結(jié)果。本試驗(yàn)從BSA自由基形成的數(shù)量表明，溫度也是影響自由基的主要因素，隨著溫度的升高，體系產(chǎn)生自由基數(shù)量也隨之增加。綜合微波溫度對(duì)BSA碳自由基、羰基、巰基和表面疏水性的結(jié)果，采用60 ℃處理對(duì)BSA的影響較小。

圖3 不同微波溫度下BSA自由基信號(hào)強(qiáng)度Figure 3 The intensity of free radical spin adducts treated in BSA at different various microwave temperature

2.4 微波時(shí)間對(duì)BSA自由基強(qiáng)度的影響

如圖4所示，在BSA溶液中自由基自旋加合物信號(hào)強(qiáng)度隨著微波加熱時(shí)間的延長(zhǎng)逐步增加，但是超過(guò)5 min的微波加熱時(shí)間，自由基信號(hào)強(qiáng)度增長(zhǎng)緩慢。初始階段是自由基積累的階段，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，自由基沒(méi)有較大的增幅。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，自由基增加的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于功率和溫度的增加而造成自由基增加的幅度，因此微波時(shí)間不是影響微波自由基的重要因素?？梢酝茰y(cè)微波加熱富含蛋白質(zhì)食物時(shí)，為了避免微波輻射對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成的影響，可以低功率、60 ℃、較長(zhǎng)時(shí)間來(lái)處理食物，這樣對(duì)富含蛋白質(zhì)食物的影響最小。

圖4 不同微波時(shí)間BSA自由基信號(hào)強(qiáng)度Figure 4 The intensity of free radical spin adducts treated in BSA at different various microwave time

2.5 微波溫度對(duì)BSA羰基含量的影響

蛋白質(zhì)羰基含量是用來(lái)衡量蛋白質(zhì)氧化程度的重要指標(biāo)之一，精氨酸、賴氨酸、組氨酸和脯氨酸上帶有的NH-或NH2-對(duì)自由基非常敏感，而這些敏感基團(tuán)發(fā)生美拉德反應(yīng)可能引入羰基結(jié)構(gòu)[15]。如圖5所示，對(duì)照組的羰基含量最低，隨著微波處理溫度的升高，BSA體系的羰基含量隨之增加，當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時(shí)，BSA的羰基含量最高。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著溫度的升高體系中的自由基增多，造成BSA氧化程度也隨之增高。微波輻射對(duì)BSA羰基含量的結(jié)果進(jìn)一步表明，適宜低于80 ℃處理樣品，對(duì)BSA羰基含量的影響較小。

2.6 微波溫度對(duì)BSA巰基含量的影響

蛋白質(zhì)中具有最高反應(yīng)活性的基團(tuán)是巰基和二硫鍵，體系中巰基被氧化轉(zhuǎn)變?yōu)槎蜴I或者二硫鍵的斷裂都對(duì)巰基含量的高低造成影響，因此巰基含量的測(cè)定是研究蛋白質(zhì)特性的重要指標(biāo)。如圖6所示，體系溫度的變化對(duì)巰基含量的影響同羰基變化趨勢(shì)恰好相反。隨著微波體系處理溫度的升高，BSA的巰基含量也隨之下降，表明蛋白質(zhì)中的巰基在微波處理?xiàng)l件下由于生成二硫鍵、亞磺酸或磺酸，導(dǎo)致BSA巰基含量下降[16]。從試驗(yàn)結(jié)果表明，在低于60 ℃條件下，巰基含量的變化不明顯；當(dāng)高于60 ℃時(shí)巰基含量發(fā)生明顯的下降。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明高溫引起B(yǎng)SA巰基含量發(fā)生變化，因此微波處理富含蛋白質(zhì)的食物宜采用低于60 ℃來(lái)減少對(duì)食物品質(zhì)的影響，劉樹(shù)萍等[17]也報(bào)道了低溫處理牛排的方法使牛排的品質(zhì)最佳。

圖5 微波輻射下BSA的羰基含量變化Figure 5 Changes in carbonyl content of BSA under microwave irradiation

圖6 微波輻射下BSA的巰基含量變化Figure 6 Changes in sulfhydryl content of BSA under microwave irradiation

2.7 微波溫度對(duì)BSA表面疏水性的變化

蛋白質(zhì)的表面疏水性是蛋白質(zhì)表面結(jié)構(gòu)重要特性之一，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和發(fā)揮蛋白質(zhì)功能活性起著決定性作用。研究蛋白質(zhì)的表面疏水性有助于了解蛋白質(zhì)在不同體系中的結(jié)構(gòu)變化等[18]。如圖7所示，與未處理的BSA相比，經(jīng)過(guò)微波處理后BSA表面疏水性增強(qiáng)。表面疏水性的增強(qiáng)可能是原來(lái)埋藏在BSA內(nèi)部的疏水區(qū)域由于微波輻射使更多疏水區(qū)域暴露于蛋白質(zhì)表面，也可能是BSA發(fā)生了折疊或伸展，當(dāng)BSA折疊時(shí)，其表面疏水性降低；當(dāng)BSA伸展時(shí)，表面疏水性增加。微波溫度低于80 ℃時(shí)，BSA 表面疏水性隨微波溫度上升而增大，可能是微波輻射的熱效應(yīng)導(dǎo)致BSA結(jié)構(gòu)變得較松散，使原本處在BSA內(nèi)部的疏水側(cè)鏈暴露出來(lái)而增大了表面疏水性。然而微波溫度高于80 ℃時(shí)，隨著微波溫度的上升BSA表面疏水性緩慢下降，可能是BSA中羰基含量的增加造成的。試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度是引起B(yǎng)SA表面疏水性變化的重要因素，為防止BSA表面疏水性發(fā)生較大變化，建議采用低于60 ℃對(duì)BSA進(jìn)行處理。

圖7 微波輻射下BSA的表面疏水性變化Figure 7 Changes in surface hydrophobicity of BSA under microwave irradiation

2.8 自由基信號(hào)強(qiáng)度與BSA羰基與巰基含量的關(guān)系

為了分析微波輻射體系中自由基生成及BSA特性的關(guān)系，以微波輻射對(duì)BSA羰基和巰基的影響作為蛋白特性的重要指標(biāo)，與微波輻射BSA體系中自由基信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行分析。由圖8表明，隨著微波處理BSA體系溫度的升高，捕獲到的自由基信號(hào)強(qiáng)度也隨之增大；BSA體系中羰基含量增加，巰基含量下降。由結(jié)果可以推測(cè)，在微波輻射BSA體系過(guò)程中，在較低的溫度下生成了少量碳原子的自由基使BSA發(fā)生了熱解，促使BSA生成分子內(nèi)或分子間二硫鍵，使巰基含量下降；而隨著微波處理溫度的升高，有可能造成部分肽鏈斷裂，促使大量的自由基生成，體系中逐步增多的碳原子的自由基進(jìn)一步使BSA中羰基和巰基含量發(fā)生變化；由于巰基是BSA中具有較高反應(yīng)活性的基團(tuán)，因此巰基與羰基比較具有更明顯的變化趨勢(shì)。

3 結(jié)論

本研究捕獲并且鑒定微波處理BSA體系中的自由基為碳自由基，證實(shí)了胡博等[4]對(duì)大米蛋白在微波處理后產(chǎn)生自由基的看法。隨著微波處理功率、溫度、時(shí)間的變大，BSA體系中的自由基強(qiáng)度呈增加的趨勢(shì)。通過(guò)測(cè)定BSA的羰基、巰基和表面疏水性等氧化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，微波通過(guò)電磁場(chǎng)使BSA體系內(nèi)部分子間發(fā)生摩擦，使分子內(nèi)和分子間形成二硫鍵造成巰基含量的降低，含有N-末端的氨基酸側(cè)鏈發(fā)生氧化反應(yīng)形成羰基，使原本處于內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致BSA部分展開(kāi)。對(duì)模式蛋白BSA的研究結(jié)果表明：采用400 W、低于60 ℃、較長(zhǎng)時(shí)間條件對(duì)BSA自由基的生成影響較小，同時(shí)對(duì)BSA氧化特性影響小。通過(guò)微波輻射模式蛋白BSA的研究結(jié)果可以推測(cè)微波輻射會(huì)造成蛋白質(zhì)體系中自由基的生成，生成的自由基使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使蛋白質(zhì)的功能發(fā)生變化。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微波功率也是生成自由基的重要因素，因此微波功率對(duì)BSA氧化特性的影響值得進(jìn)一步探討。

圖8 微波輻射對(duì)BSA中羰基、巰基含量及自由基信號(hào)強(qiáng)度的影響Figure 8 Effect of carbonyl, sulfhydryl contents and signal intensities of radical during microwave irradiation in BSA