周繼月，楊盼盼，劉磊，尹曉東，侯英，楊式華

1 云南省煙草煙葉公司 技術中心 昆明 651208；

2 云南同創(chuàng)檢測技術股份有限公司 研發(fā)中心 昆明 650106

由于煙葉采收的季節(jié)性和打葉復烤的計劃性，初烤煙葉復烤前需存儲一段時間，存儲過程中煙葉由于受到環(huán)境溫濕度及存儲條件的影響容易發(fā)生霉變[1-2]，給煙草復烤加工企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，因此如何有效對初烤煙葉霉變進行預警對預防煙葉霉變具有較好的應用價值?，F(xiàn)有文獻[3-5]多以環(huán)境溫濕度和煙葉含水率為自變量進行煙葉霉變預測。上述方法多基于煙葉所處的環(huán)境和含水率，缺乏對霉變過程煙葉內在化學成分變化的規(guī)律研究。

煙葉霉變過程伴隨著煙葉攜帶霉變微生物孢子萌發(fā)、生長和繁殖等過程[6]，上述過程中微生物代謝產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物往往對煙葉霉變過程具有較好的指示性作用。麥角甾醇作為一種植物甾醇可以用來監(jiān)控煙草早期霉變[7-8]。目前麥角甾醇含量檢測方法包括：薄層色譜[9]、高效液相色譜[10]和氣質聯(lián)用[7]。煙草中麥角甾醇含量測定多采用氣質聯(lián)用[7]。上述方法存在前處理復雜、檢測周期長等缺點。近紅外光譜分析技術作為一種簡便、快速、無損的檢測方法已被應用于不同基質中真菌毒素的定量檢測[11]。國內外的研究者已經(jīng)將近紅外分析技術應用于小麥[12]、玉米[13]和土壤[14]中麥角甾醇含量的快速測定，取得了較好的應用效果，因此采用近紅外光譜分析技術快速表征煙葉霉變過程中的麥角甾醇含量具有一定可行性。

近紅外光譜分析技術通過結合化學計量學方法，建立定量及定性模型實現(xiàn)對煙草中化學成分含量測定及含量變化趨勢的預測[15-16]。為提高近紅外建立模型的穩(wěn)定性和預測精度，應對特征變量有效信息進行篩選[17]。由于篩選出來的近紅外光譜信息往往具有多維性，需結合主成分分析將多維信息反映到較少的新變量上，通過分析新變量達到多元統(tǒng)計監(jiān)測物質化學成分含量的變化趨勢，已經(jīng)應用在許多領域[18]。Hotelling T2檢驗是主成分分析中一種常用多變量檢驗方法，是單變量檢驗的自然推廣，常用于兩組均向量的比較[19]。

鑒于此，調節(jié)煙葉含水率和環(huán)境溫濕度，通過肉眼識別煙葉是否出現(xiàn)霉變及檢測初烤煙葉霉變過程中的麥角甾醇含量和近紅外光譜信息，并采用化學計量學方法競爭自適應重加權[20](Competitive Adaptive Reweighted Sampling Method,CARS)篩選出近紅外光譜中對煙葉麥角甾醇含量“敏感”的光譜信息，本研究擬首次建立基于上述近紅外光譜信息的主成分分析和Hotelling T2統(tǒng)計量的煙葉霉變預警定性模型，以期為初烤煙葉霉變的準確、快速預警提供一種切實可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

20個煙葉樣品來源于2015年和2016年云南5個地區(qū)(臨滄、普洱、昆明、曲靖和文山)2個等級(B2F和C3F)的初烤煙葉，由云南煙草煙葉公司技術中心提供，詳細的樣品信息如表1所示。

表1 初烤煙葉樣品序號、年份、地區(qū)及等級信息Tab.1 Sample information including sequence number,year,producing area and grades

KBF240恒溫恒濕箱(德國Binder公司)；GC6890N/MS5975C氣質聯(lián)用儀(美國Agilent)；Nicolet Antaris II型FT-NIR近紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司)；AE200型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；CT410旋風磨(丹麥Foss公司)。

1.2 方法

1.2.1 煙葉霉變實驗

參照文獻[21]對初烤煙葉樣品的煙葉含水率進行調節(jié)，采用烘箱干燥法[22]測定煙葉含水率，使煙葉含水率達到18％(誤差±0.3％)。將預處理后的初烤煙葉樣品放入恒溫恒濕箱，調節(jié)溫、濕度分別為28℃和80％條件下進行煙葉霉變實驗，以30天為實驗周期，2天取樣一次。

1.2.2 麥角甾醇含量測定

參照文獻[7]方法檢測初烤煙葉麥角甾醇含量。

1.2.3 近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集

取實驗過程中的1～2整片煙葉樣品，旋風磨粉碎，過60目篩。參照標準方法[23]采集初烤煙葉樣品近紅外光譜數(shù)據(jù)。其中第0d的樣品平行采集6份，用于建立主成分分析模型；第3d至第30d樣品采集1份，用于輸入主成分模型，提取Hotelling T2統(tǒng)計量進行煙葉霉變預測。上述樣品均重復取樣3次采集近紅外光譜，以平均光譜作為樣品光譜。

1.2.4 光譜預處理及特征波長范圍篩選

近紅外光譜預處理，采用多元散射校正(MSC)+二階求導+Norris(5,5)平滑光譜方法對近紅外光譜進行預處理，用于消除粉末樣品顏色、粒徑和儀器硬件性能對近紅外光譜基線漂移和噪聲的影響[24]，上述過程由TQ Analyst 9.3(美國Thermo Fisher公司)軟件完成。

波長變量篩選，采用競爭自適應重加權(CARS)方法篩選出預處理后的近紅外光譜數(shù)據(jù)中與麥角甾醇含量強相關性波長變量范圍，用于提高主成分分析的指征性[25]。CARS算法主要參數(shù)：最大主成分數(shù)為15、蒙特卡羅運算樣本數(shù)為50、交互驗證樣本數(shù)5、運行次數(shù)100；變量重要性評價指標為算法運行100次，統(tǒng)計每個變量被選中的概率，基于模型的內部交互驗證，選取被選頻率前200波長變量進入主成分分析，上述過程由MATLAB 6.0(Mathwork,USA)軟件完成。

1.2.5 主成分分析和基于Hotelling T2統(tǒng)計量的監(jiān)測模型建立

將上述篩選出的波長變量導入SIMCA-P+11.5(Umetrics,Sweden)軟件進行主成分分析，通過提取Hotelling T2統(tǒng)計量，建立監(jiān)測模型，以Hotelling T2統(tǒng)計量的95％置信限作為初烤煙葉霉變預警限，用于對初烤煙葉霉變預警。

2 結果

2.1 煙葉霉變實驗

2015年和2016年云南5個地區(qū)(臨滄、普洱、昆明、曲靖和文山)2個等級(B2F和C3F)的初烤煙葉在30d實驗周期內霉變程度及出現(xiàn)肉眼可見霉變天數(shù)如表2所示。由表2可知，20個初烤煙葉樣本中出現(xiàn)霉變的樣本為13個(其中霉變10個，輕微霉變3個)，未霉變煙葉7個，典型的霉變、輕微霉變、未霉變和肉眼可見霉變煙葉如圖1所示。

表2 初烤煙葉樣品實驗周期內霉變程度及肉眼可見霉變時實驗天數(shù)Tab.2 Degree of flue-cured tobacco leaf mildew and the time of macroscopic tobacco mildew

圖1 典型的霉變、輕微霉變、未霉變和肉眼可見霉變初烤煙葉圖Fig.1 Typical pictures of tobacco serious mildew,slight mildew,no mildew and macroscopic mildew

2.2 煙葉霉變過程中麥角甾醇含量變化規(guī)律

2015年和2016年云南5個地區(qū)(臨滄、普洱、昆明、曲靖和文山)2個等級(B2F和C3F)的20個初烤煙葉樣本30d實驗周期內麥角甾醇含量如表3所示。由表3可知，30d霉變實驗周期內發(fā)生霉變的初烤煙葉麥角甾醇含量出現(xiàn)先逐漸增加后逐漸降低的趨勢，當肉眼可見時，麥角甾醇含量較初始值增加4.66～23.38倍；30d霉變實驗周期內未發(fā)生霉變初烤煙葉含量變化小。注：表中數(shù)字加黑表示煙葉表面開始出現(xiàn)肉眼可見霉變；增加倍數(shù)表示肉眼可見霉變時煙葉麥角甾醇含量/0d時該樣品的麥角甾醇含量。

表3 初烤煙葉樣品30d實驗周期內麥角甾醇含量Tab.3 Content of ergosterol of flue-cured tobacco leaf within the 30-days experiment period μg/g

2.3 麥角甾醇含量強相關性近紅外光譜范圍的篩選

采用多元散射校正(MSC)+二階求導+Norris(5,5)平滑光譜方法預處理前后初烤煙葉近紅外光譜如圖2所示。采用CARS方法計算波長變量重要性參數(shù)如圖3所示。由圖3可知，近紅外光譜信息中對初烤煙葉麥角甾醇含量“敏感”光譜主要波長范圍為4180-4200cm-1、5083-5095cm-1、5349-5372cm-1、5696-5719cm-1、6255-6267cm-1、6390-6417cm-1、6444-6475cm-1、6610-6633cm-1、6819-6849cm-1、7494-7501cm-1、7744-7764cm-1、7802-7821cm-1、7856-7887cm-1、7949-7995cm-1、8138-8154cm-1和8782-8801cm-1。

2.4 基于Hotelling T2統(tǒng)計量的煙葉霉變預測模型

以2016年曲靖B2F煙葉未霉變、2016年臨滄B2F煙葉輕微霉變、2015年普洱C3F煙葉霉變3個樣品的Hotelling T2統(tǒng)計量過程為列，其模型監(jiān)測圖如圖4-圖6所示。

圖2 初烤煙葉霉變過程中原始的近紅外光譜(a)和預處理后的光譜(b)Fig.2 Typical raw(a)and Pretreatment(b)near infrared spectroscopy of tobacco

圖3 CARS篩選出的變量(波數(shù))重要性頻率Fig.3 Screened spectrum rang of CARS

圖4 基于Hotelling T2統(tǒng)計量的煙葉未霉變過程監(jiān)測圖Fig.4 Hotelling T2 monitor graph of no mildew of tobacco

由圖4可知，2016年曲靖B2F初烤煙葉樣品第0d的6個建模樣品(圖中以實心方點標識)均在Hotelling T2的95％置信期間內；第3d至第30d的10個預測樣品(圖中以實心三角形標識)亦均在Hotelling T2的95％置信期間內。由表2可知，該樣品30d實驗周期內未見肉眼可見煙葉，模型未出現(xiàn)預警信號。

圖5 基于Hotelling T2統(tǒng)計量的煙葉輕微霉變過程監(jiān)測圖Fig.5 Hotelling T2 monitor graph of slight mildew of tobacco

由圖5可知，2015年臨滄B2F初烤煙葉樣品第0d的6個建模樣品(圖中以實心方點所示)均在Hotelling T2的95％置信期間內；第3d～21d的7個預測樣品(圖中以實心三角形所示)均在Hotelling T2的95％置信期間內；第24d樣品預測點開始超出Hotelling T2的95％置信期間；第27d和30d樣品預測點均超出Hotelling T2的95％置信期間。由表2可知，該樣品肉眼可見的霉變天數(shù)為30天，模型的預警天數(shù)為24天，實現(xiàn)了對霉變過程預警提前6天。

圖6 基于Hotelling T2統(tǒng)計量的煙葉霉變過程監(jiān)測圖Fig.6 Hotelling T2 monitor graph of serious mildew of tobacco

由圖6可知，2015年普洱C3F初烤煙葉樣品第0d的6個建模樣品(圖中以實心方點標識)均在Hotelling T2的95％置信區(qū)間內；第3d、6d和9d的3個預測樣品(圖中實心三角形標識)均在Hotelling T2的95％置信期間內；第12d樣品預測點開始超出Hotelling T2的95％置信期間；第15d～30d樣品預測點均超出Hotelling T2的95％置信期間。由表2可知，該樣品肉眼可見的霉變天數(shù)為15天，模型的預警天數(shù)為12天，實現(xiàn)了對霉變過程預警提前3天。

2015年和2016年云南5個地區(qū)(臨滄、普洱、昆明、曲靖和文山)2個等級(B2F和C3F)中初烤煙葉在30d實驗周期內出現(xiàn)肉眼可見霉變天數(shù)及Hotelling T2統(tǒng)計模型預警天數(shù)如表4所示。由表4可知，13個霉變煙葉中出現(xiàn)Hotelling T2統(tǒng)計模型預警天數(shù)先于肉眼可見霉變天數(shù)有9個樣品，提前預警天數(shù)為6天的樣品2個，占總霉變樣品總數(shù)的15.38％；提前預警天數(shù)3天的樣品7個，占總霉變樣品總數(shù)的53.85％；當天預警的樣品4個，占總霉變樣品總數(shù)的30.77％；7個未發(fā)生霉變煙葉在30天的監(jiān)測周期內均未出現(xiàn)預警，預測準確率100％。

表4 實驗周期內肉眼可見煙葉霉變時實驗天數(shù)及Hotelling T2統(tǒng)計模型預警天數(shù)Tab.4 Time of macroscopic and model pre-warning tobacco mildew

3 討論

目前文獻[26-27]報道的煙葉霉變預測多基于存儲環(huán)境溫濕度，缺乏對煙葉本身理化性質影響煙葉霉變的考量?；跓熑~麥角甾醇含量變化，采用近紅外光譜分析結合化學計量學方法建立煙葉霉變過程的模式識別模型，對煙葉霉變過程具有較好預警效果。本研究結構表明初烤煙葉霉變過程中麥角甾醇含量呈現(xiàn)逐漸增加后逐漸降低的變化趨勢，與文獻[28]報道的結果相符合。采用近紅外光譜能定量分析煙葉中麥角甾醇含量[29]表明近紅外光譜中存在對麥角甾醇含量“敏感”的光譜信息。本文應用近紅外光譜預測煙葉霉變具有一定的合理性和可操作性。

較煙葉麥角甾醇近紅外光譜分析定量分析，本研究針對單個煙葉樣品采用過程模式識別監(jiān)測初烤煙葉霉變過程中麥角甾醇含量變化，能較好的排除煙葉地區(qū)、部位和等級差異對建立近紅外模型無關背景光譜信息的影響。在實際應用方面，較定量模型，定性模型不需繁雜的麥角甾醇含量化學測定步驟，能提高近紅外預測初烤煙葉霉變效率。為提高近紅外光譜分析技術預警初烤煙葉霉變的效果可篩選更“靈敏”反映煙葉霉變過程且與近紅外光譜信息密切相關的霉變標志物。

為有效防止生產(chǎn)現(xiàn)場煙葉霉變的發(fā)生，基于上述預警結果，可根據(jù)煙葉產(chǎn)地、部位和含水率劃分防霉等級，針對不同防霉等級煙葉，采用不同的堆垛架、堆垛高度和煙堆覆蓋材料，同時制定不同強度的煙堆溫濕度監(jiān)測強度。對發(fā)現(xiàn)肉眼可見霉變煙堆采用物理去除霉變煙葉和翻垛等的措施。

4 結論

(1)煙葉霉變過程中，麥角甾醇含量逐漸增加后逐漸降低，當肉眼可見時，麥角甾醇含量較初始值增加4.66～23.38倍；

(2)通過波長篩選，煙葉麥角甾醇含量“敏感”近紅外光譜主要波長范圍為4180-4200cm-1、5083-5095cm-1、5349-5372cm-1、5696-5719cm-1、6255-6267cm-1、6390-6417cm-1、6444-6475cm-1、6610-6633cm-1、6819-6849cm-1、7494-7501cm-1、7744-7764cm-1、7802-7821cm-1、7856-7887cm-1、7949-7995cm-1、8138-8154cm-1和8782-8801cm-1；

(3)采用基于麥角甾醇含量的近紅外光譜信息主成分分析Hotelling T2監(jiān)測模型，13個霉變的煙葉樣品中，提前預警天數(shù)為6天的樣品2個，占總霉變樣品總數(shù)的15.38％；提前預警天數(shù)3天的樣品7個，占總霉變樣品總數(shù)的53.85％；當天預警的樣品4個，占總霉變樣品總數(shù)的30.77％；7個未發(fā)生霉變煙葉在30天的監(jiān)測周期內均未出現(xiàn)預警，預測準確率100％。該方法能方便快速的實現(xiàn)對初烤煙葉霉變預警，具有較好的實用價值。

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