李晶晶，史宏志，楊興有，楊吉光，李傳勝，鄭昕，王俊

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州市文化路95號(hào) 450002；

2 四川省煙草公司達(dá)州市公司，四川省達(dá)州市柴市街212號(hào) 635000

氨基酸是煙草中的重要化合物之一，在煙草的生長、調(diào)制、醇化、工業(yè)加工直至抽吸過程中都起著十分重要的作用[1-3]，它既是合成蛋白質(zhì)的原料，又是蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物，同時(shí)也是合成煙堿、多酚等物質(zhì)的前體，對(duì)煙株體內(nèi)碳氮代謝及煙葉品質(zhì)貢獻(xiàn)很大。氨基酸在煙株體內(nèi)大多結(jié)合在蛋白質(zhì)中，除此以外，還有一部分非蛋白氨基酸以游離態(tài)形式存在。游離氨基酸和蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的氨基酸與糖類化合物發(fā)生非酶棕色化反應(yīng)是煙葉香味物質(zhì)的重要來源[4-8]，研究煙葉在不同生育時(shí)期、葉位以及調(diào)制前后煙葉中氨基酸含量的變化規(guī)律對(duì)煙草栽培理論和煙葉品質(zhì)的提升具有指導(dǎo)作用。煙草中氨基酸的含量在不同類型煙草及品種間并不相同，而且受環(huán)境、栽培措施及調(diào)制方式的影響較大。在游離氨基酸方面，有研究表明[9]白肋煙、香料煙和烤煙的煙葉中所含游離氨基酸總量及所含主要游離氨基酸種類上均存在顯著差異。符云鵬等[10]對(duì)烤煙不同葉片發(fā)育過程中游離氨基酸總量變化的研究結(jié)果表明，煙葉中游離氨基酸總量在生育期的變化趨勢是幼葉含量高，進(jìn)入成熟期后明顯下降。Weybrew等[11]報(bào)道，煙葉在調(diào)制過程中，總游離氨基酸含量逐漸增加，調(diào)制后的煙葉含有44種氨基酸，其中以脯氨酸和天門冬酰胺的含量最多。在總氨基酸方面，孫紅戀等[12-13]研究表明總氨酸含量與砍收期相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，且晾制前砍收越早，蛋白質(zhì)完全水解的總氨基酸含量越多。王愛華等[14]研究顯示烘烤過程中階梯升溫變黃處理有利于變黃末期及烤后煙葉大部分Amadori有關(guān)的氨基酸及其他種類氨基酸含量的積累，利于香氣質(zhì)、香氣量及評(píng)吸質(zhì)量的提高。趙銘欽等[15]研究發(fā)現(xiàn)煙葉著生部位不同，蛋白質(zhì)的降解程度和氨基酸的積累程度明顯不同，因此可把氨基酸在成熟期間總量的動(dòng)態(tài)變化作為煙葉適熟采收的一個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)。

雖然前人對(duì)煙葉中氨基酸含量變化規(guī)律研究較多，但對(duì)曬紅煙氨基酸含量變化的研究較少，尤其是不同采收期和調(diào)制方式下煙葉中氨基酸含量的變化鮮有報(bào)道。萬源曬煙以曬紅煙萬毛3號(hào)品種為主，顏色多呈深褐色或紅黃色，光澤鮮明，油分充足，身份中等至較厚，彈性較強(qiáng)，煙堿等含氮化合物高，含糖低，煙氣香味濃厚豐滿，勁頭和刺激性大，主要用作雪茄原料，也可用于雪茄型卷煙和混合型卷煙中，鼻煙中亦可使用。雖然近年來烤煙的發(fā)展對(duì)曬煙產(chǎn)業(yè)造成了一定的沖擊，但由于國內(nèi)煙葉政策性調(diào)控和國際控?zé)煹挠绊?，?duì)于不同類型煙葉的使用出現(xiàn)了新的趨勢，特別是晾曬煙在烤煙型卷煙制品降焦減害方面的使用成為了當(dāng)前一個(gè)熱點(diǎn)。本文以曬紅煙萬毛3號(hào)為材料，研究了不同采收期和調(diào)制方式下煙葉調(diào)制前后總氨基酸含量和比例的變化，揭示不同時(shí)期煙葉中氨基酸含量的變化規(guī)律，為生產(chǎn)中制訂合理栽培及調(diào)制措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為曬煙品種萬毛3號(hào)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)設(shè)置在四川省萬源市草壩鎮(zhèn)，植煙密度為16667株/hm2，行株距1.2m×0.5m，施氮量225kg/hm2。試驗(yàn)煙株5月5日移栽，7月4日(移栽后60d)打頂。試驗(yàn)設(shè)置采收時(shí)期和調(diào)制方式2個(gè)因素，采收時(shí)期設(shè)打頂后25d、30d、35d、40d采收4個(gè)水平，分別進(jìn)行晾制和曬制，共8個(gè)處理，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

取樣：各處理上二棚煙葉均在采收和調(diào)制結(jié)束時(shí)取樣。將所取樣品烘干后磨碎過孔徑0.25mm的篩，取混合樣品10g用于測定氨基酸含量。

1.3 氨基酸含量測定

采用S-433 D型全自動(dòng)氨基酸分析儀(德國SYKAM公司)按照GB/T 5009.124-2003標(biāo)準(zhǔn)測定煙葉中氨基酸含量，結(jié)果為蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的游離氨基酸及煙葉本身存在的游離態(tài)非蛋白氨基酸的總和。具體檢測方法如下：首先稱量0.1000g煙末于水解管中，之后加入10mL 6mol/L的鹽酸和新蒸餾的苯酚3～4滴，將水解管放入冷凍劑中3～5min，再抽真空充入高純氮?dú)?；重?fù)3次后，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口或擰緊螺絲蓋，將已封口的水解管放在(110±1)℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22h后取出冷卻。將水解液過濾后全部轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中定容。吸取濾液1mL于5mL容量瓶內(nèi)，用真空干燥器在40～50℃干燥，殘留物用1～2mL水溶解，再干燥，反復(fù)進(jìn)行2次，最后蒸干，用1mL pH2.2的緩沖液溶解，供儀器測定用。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行成對(duì)數(shù)據(jù)t測驗(yàn)；用SPSS 22.0軟件單(多)因素方差分析和Duncan多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用DPS軟件歐式距離最長距離法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采收時(shí)期對(duì)新鮮煙葉氨基酸含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同采收時(shí)期鮮煙葉氨基酸含量差異顯著(表1)。鮮煙葉中總氨基酸含量平均值為147.9mg/g，變化范圍在140.8～155.6mg/g之間，隨采收期推遲呈先下降后上升的趨勢，打頂后35d采收含量最低，為140.8mg/g，打頂后25d采收含量最高，為155.6mg/g。

鮮煙葉中含量最多的氨基酸為谷氨酸，其含量在16.4～21.0mg/g范圍內(nèi)，平均18.5mg/g，占氨基酸總量11.4％～13.8％，變化趨勢表現(xiàn)為隨采收期推遲先升高后降低，打頂后30d采收含量最高，打頂后40d采收最低。其次是天冬氨酸，其含量隨采收期的推遲先減少后增加，打頂后25d采收含量最高，打頂后35d采收最低，變化范圍在14.4～17.3mg/g之間，平均15.9mg/g，占氨基酸總量10.2％～11.1％。其余氨基酸含量較低，均不超過15mg/g，占氨基酸總量比例在10％以下?？傮w來看，打頂后35d采收的煙葉氨基酸含量與其他采收時(shí)間相比差異明顯，天冬氨酸、谷氨酸等多種氨基酸及氨基酸總量差異達(dá)到顯著水平。

2.2 采收時(shí)期和調(diào)制方式對(duì)調(diào)制后煙葉氨基酸含量的影響

2.2.1 采收時(shí)期和調(diào)制方式對(duì)調(diào)制后煙葉氨基酸含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，采收時(shí)期和調(diào)制方式對(duì)調(diào)制后煙葉氨基酸含量的影響均存在顯著差異(表2，表3)。調(diào)制后煙葉氨基酸總量降至99.3～107.3mg/g，平均104.0mg/g，降幅29.7％。其中含量最多的氨基酸為天冬氨酸，其含量隨采收期的推遲先增加后減少，變化范圍在19.7～28.8mg/g之間，平均24.5mg/g，比調(diào)制前增加8.7mg/g，增幅28.9％。其次是谷氨酸，其含量隨采收期推遲先降低后升高，變化范圍在13.9～16.2mg/g之間，平均15.0mg/g，比調(diào)制前降低3.5mg/g，降幅18.9％。其余氨基酸含量較低，均不超過10mg/g。

表1 采收時(shí)期對(duì)調(diào)制前煙葉氨基酸含量的影響Tab.1 Effect of harvesting time on amino acids content in tobacco leaves before curing

調(diào)制方式對(duì)氨基酸總量的影響雖沒有達(dá)到顯著水平，但氨基酸總量隨采收期推遲的變化趨勢有一定差異。晾制條件下隨采收期推遲氨基酸總量呈持續(xù)上升趨勢，曬制條件下則呈先上升后下降趨勢。對(duì)于采收較早的煙葉，曬制有利于提高其氨基酸含量，特別是天冬氨酸含量，打頂后25、30d采收的煙葉曬制后天冬氨酸含量約比晾制增加5.6mg/g，增幅24.14％～28.93％；打頂后35、40d采收的煙葉則表現(xiàn)為曬制低于晾制。谷氨酸含量多表現(xiàn)為曬制高于晾制。

表2 不同采收時(shí)期和調(diào)制方式煙葉調(diào)制后的氨基酸含量Tab.2 The content of amino acids in tobacco leaves after different harvesting time and curing method mg/g

表3 采收時(shí)期和調(diào)制方式對(duì)氨基酸含量影響兩因素方差分析表Tab.3 Two factor analysis of effects of harvesting time and curing method on amino acid content

2.2.2 采收時(shí)期和調(diào)制方式對(duì)調(diào)制后煙葉氨基酸比例的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，在各采收時(shí)期占氨基酸總量比例最大的均為天冬氨酸，變化范圍為19.8％～27.5％；其次是谷氨酸，占氨基酸總量比例為13.0％～15.5％；苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、脯氨酸占氨基酸總量比例為5％～10％；其余氨基酸占氨基酸總量比例較低，不超過5％。采收時(shí)期及兩因素互作對(duì)各氨基酸比例影響均達(dá)到顯著水平。調(diào)制方式對(duì)天冬氨酸的占比影響較大，達(dá)到極顯著水平，曬制有利于提高早采煙葉的天冬氨酸含量，但隨采收時(shí)間推遲，曬制后天冬氨酸比例下降幅度較大；其余16種氨基酸的比例受調(diào)制方式影響較小，但除苯丙氨酸外均達(dá)到顯著水平(表4，表5)。

表4 不同采收時(shí)期和調(diào)制方式煙葉調(diào)制后的氨基酸比例Tab.4 The ratio of amino acids in tobacco leaves at different harvesting time and by different curing methods ％

2.3 采收時(shí)期和調(diào)制方式對(duì)調(diào)制前后煙葉氨基酸含量變化的影響

對(duì)采收時(shí)期和調(diào)制方式影響煙葉調(diào)制前后氨基酸含量變化的試驗(yàn)表明，除胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸差異不顯著外，其余氨基酸在調(diào)制前后的差異均達(dá)到顯著水平，其中天冬氨酸、亮氨酸及氨基酸總量在調(diào)制前后的差異達(dá)到極顯著水平(表5)。同一調(diào)制方式下，天冬氨酸、谷氨酸調(diào)制前后的變化量隨采收期推遲均呈先增加后減少的變化趨勢，亮氨酸、苯丙氨酸的變化量則隨采收期推遲持續(xù)降低。

對(duì)同一采收時(shí)期兩種調(diào)制方式下的變化值進(jìn)行成對(duì)數(shù)據(jù)的t測驗(yàn)，結(jié)果表明雖然氨基酸總量受調(diào)制方式影響未達(dá)到顯著水平，但各氨基酸對(duì)調(diào)制方式的反應(yīng)不同，除天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸的變化量表現(xiàn)為曬制高于晾制外，其余類型氨基酸均表現(xiàn)為晾制高于曬制，其中，天冬氨酸在兩種調(diào)制方式下的增加量差異達(dá)到了顯著水平。

煙葉調(diào)制前后氨基酸變化量的聚類分析結(jié)果顯示，在相似性系數(shù)為27.50處，可將調(diào)制過程中唯一含量大幅增加的天冬氨酸與其余16種氨基酸劃分開，而其余的16種氨基酸在適當(dāng)?shù)南嗨菩韵禂?shù)處則能很清晰的聚為3組(圖1)。其中胱氨酸、蛋氨酸、組氨酸變化量最小，約0～2mg/g，亮氨酸變化量最大，約6～9mg/g，其余氨基酸的變化量適中，在2～6mg/g之間。

表5 不同采收時(shí)期和調(diào)制方式煙葉調(diào)制前后氨基酸變化情況分析Tab.5 Analysis of amino acid changes before and after curing of tobacco leaves at different harvesting time and by different curing methods mg/g

圖1 17種氨基酸的聚類分析樹狀圖Fig.1 Dendrogram derived from the longest distance cluster analysis of 17 amino acids

3 討論

在煙葉生長發(fā)育和成熟衰老過程中，葉片氨基酸含量和組成不斷發(fā)生變化，且與碳氮代謝水平密切相關(guān)，進(jìn)而對(duì)煙葉香味品質(zhì)產(chǎn)生影響[1-2]。曬煙鮮煙葉中含量最高的是天冬氨酸和谷氨酸，其中谷氨酸是植物體內(nèi)氮同化途徑中的第一個(gè)含氮化合物，為其他氨基酸進(jìn)行生物合成提供氨基(-NH)[16]，天冬氨酸是天冬酰胺、賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸的合成前體。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，采收時(shí)期對(duì)鮮煙葉中的谷氨酸、天冬氨酸及氨基酸總量有顯著影響，各氨基酸及氨基酸總量在打頂后35d降至最低；采收時(shí)期對(duì)調(diào)制后煙葉中氨基酸總量和天冬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸等影響較大，對(duì)組氨酸等含量影響較小，調(diào)制后氨基酸含量隨采收期推遲呈現(xiàn)增加后降低趨勢，以打頂后35d較高。以上研究結(jié)果表明采收時(shí)期與煙葉調(diào)制前后氨基酸含量變化關(guān)系密切，適時(shí)采收對(duì)調(diào)控?zé)熑~中的氨基酸含量作用很大，這與柴家榮等[16]的研究結(jié)果一致。

曬煙煙葉在調(diào)制過程中，鮮煙葉內(nèi)含物質(zhì)在外界溫、濕度作用下發(fā)生復(fù)雜的生理與生物化學(xué)變化，這種變化過程與環(huán)境條件密切相關(guān)，采取適宜的調(diào)制方式和技術(shù)，不僅有利于調(diào)制優(yōu)質(zhì)煙葉，還可對(duì)煙葉風(fēng)格產(chǎn)生一定影響，對(duì)滿足卷煙企業(yè)不同風(fēng)格卷煙生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)研究了晾、曬兩種調(diào)制方式對(duì)調(diào)制后煙葉氨基酸含量的影響，結(jié)果表明，受調(diào)制方式影響最大的是天冬氨酸，其次是谷氨酸、苯丙氨酸及氨基酸總量，其中天冬氨酸含量在調(diào)制后大幅增加，而其他多數(shù)氨基酸含量顯著下降，這與本課題組對(duì)白肋煙及其他晾曬煙的研究結(jié)論相似[17]，因此高天冬氨酸比例可能是典型晾曬煙的共同特點(diǎn)。天冬氨酸占總氨基酸的比例也可作為反應(yīng)晾曬煙風(fēng)格典型性的一個(gè)指標(biāo)，同時(shí)也可反映煙葉調(diào)制過程中物質(zhì)的轉(zhuǎn)化程度和質(zhì)量表現(xiàn)[17-18]。鑒于以上分析，在打頂后30～35d采收更有利于彰顯萬源曬煙風(fēng)格特色，提升煙葉品質(zhì)，其中成熟度低的煙葉宜采用曬制方式，而成熟度高的煙葉則宜采用晾制方式。關(guān)于煙葉晾曬過程中天冬氨酸含量增高的機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

萬源曬煙鮮煙葉以谷氨酸和天冬氨酸為主，其中谷氨酸含量隨成熟度增加先升高后降低，天冬氨酸含量則先降低后升高。調(diào)制后氨基酸總量比鮮煙葉顯著降低，且氨基酸組成發(fā)生較大變化，調(diào)制后天冬氨酸大幅增加，而谷氨酸等大多數(shù)氨基酸調(diào)制后顯著降低，高天冬氨酸比例是萬源曬煙化學(xué)組成的顯著特點(diǎn)。采收時(shí)期和調(diào)制方式對(duì)煙葉中氨基酸組成比例及氨基酸總量的變化影響較大，隨采收期推遲，氨基酸總量呈增加趨勢，晾制時(shí)持續(xù)升高，曬制則呈先上升后下降趨勢。調(diào)制方式影響最大的是天冬氨酸，煙葉成熟度低時(shí)曬制煙葉天冬氨酸含量高于晾制煙葉，成熟度高時(shí)則是晾制高于曬制。通過控制成熟度和選擇調(diào)制方式有利于生產(chǎn)特色優(yōu)質(zhì)曬煙以滿足卷煙風(fēng)格的多樣化需要。

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