皇甫彩娟，董 楠，陸 茜，羅 明 ,李衛(wèi)軍

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

經(jīng)過磁場靜止處理或以一定流速經(jīng)過磁場、垂直切割磁力線后的水稱之為磁化水。在洛倫茲力的作用下，磁化后的水分子間氫鍵減弱、結(jié)構(gòu)狀態(tài)發(fā)生改變、聚合度降低，導(dǎo)致水的活性增加，滲透力、電導(dǎo)率、溶解度、透光率、揮發(fā)性及 pH 等諸多物理化學(xué)性質(zhì)都發(fā)生變化[1]。磁化水技術(shù)裝置簡單，節(jié)能環(huán)保，現(xiàn)已應(yīng)用于防治水垢[2]、污水處理[3]和農(nóng)業(yè)[4]等領(lǐng)域，并取得了一定效益。近年來，磁化水在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注和日益深入的研究。研究表明，在優(yōu)化磁場的作用下，磁化水浸種可增加種子活性、提高抗逆性、促進(jìn)幼苗生長和營養(yǎng)吸收利用[5-6]；磁化水灌溉應(yīng)用在棉花、玉米、番茄、小麥和蠶豆等[7-11]作物上能提高產(chǎn)量和品質(zhì)，還具有改善土壤肥力、提高土壤脫鹽率等功效[12-14]。近年來，將磁化水與滴灌相結(jié)合的磁化水滴灌成為一種新型節(jié)水技術(shù)在棉花、小麥、苜蓿[15]等作物栽培中試驗(yàn)應(yīng)用，能顯著提高水分利用效率，在水資源短缺的中西部干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。目前，磁化水處理對(duì)微生物的生物生長和代謝影響的研究鮮有報(bào)道。馬放等[16]研究發(fā)現(xiàn)磁場對(duì)硝化細(xì)菌生長有明顯的促進(jìn)作用，而對(duì)反硝化細(xì)菌的生長則表現(xiàn)出一定的負(fù)效應(yīng)。而王祥三等[17]試驗(yàn)得出，磁場強(qiáng)度為2 100 Gs 的磁處理水可使70%以上細(xì)菌死亡，存活下來的細(xì)菌發(fā)生變異，具有更強(qiáng)的生存能力。研究發(fā)現(xiàn)，不同磁場強(qiáng)度、作用時(shí)間、磁化次數(shù)(頻率)處理的磁化水，針對(duì)不同微生物菌株的影響不同，會(huì)產(chǎn)生不同的效果。在一定情況下磁化水對(duì)微生物生長起促進(jìn)作用，但超過一定范圍可能會(huì)產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。因此，如何優(yōu)化磁化水技術(shù)、促進(jìn)有益微生物生長，抑制和減少有害微生物的危害是磁化水應(yīng)用中亟需解決的問題。本試驗(yàn)以根瘤菌、生防芽孢桿菌 2 種益微菌為研究材料，研究不同磁化水處理對(duì)有益微生物生長及功能的影響，明確磁化水的生物效應(yīng)，為磁化水技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 磁化器及磁化水的制備

4 000 Gs采用外置式強(qiáng)磁水處理 JBMS-cw 50(上海長創(chuàng)水處理設(shè)備有限公司)，20 000 Gs磁化器采用外置式強(qiáng)磁水處理 DW-II(哈爾濱大禹磁處理開發(fā)有限公司)。以自來水(水流速為 3 m·s-1)分別制備流水切割4 000 Gs 磁化處理1～3次的磁化水和20 000 Gs磁化處理1次的磁化水。

1.2 供試的苜蓿種子

供試種子為‘新牧一號(hào)’雜花苜蓿，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院提供。

1.3 供試菌株

根瘤菌株：苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)XGL026，為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室(以下簡稱本實(shí)驗(yàn)室)在前期研究中從新疆紫花苜蓿根瘤中分離、篩選出的固氮活性高、抗逆性強(qiáng)、具有促生性能的苜蓿根瘤菌株。S.melilotiXGL026-GFP為本實(shí)驗(yàn)室采用三親本雜交法構(gòu)建的攜帶有綠色熒光蛋白基因GFP和四環(huán)素抗性基因的標(biāo)記菌株。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 2-4菌株：為本實(shí)驗(yàn)室分離、保存的對(duì)棉花黃萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)具有較強(qiáng)抑菌活性的拮抗菌株。

棉花黃萎病菌株：由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系提供。

1.4 培養(yǎng)基

根瘤菌、枯草桿菌培養(yǎng)分別采用甘露醇酵母汁培養(yǎng)基[18]和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[19]；棉花黃萎病菌孢子液培養(yǎng)采用查氏培養(yǎng)基；抑菌活性測定采用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PDA)[19]。

1.5 磁化水對(duì)苜蓿根瘤菌生長的影響

分別用4 000 Gs 磁化器處理 1次(T1)、2次(T2)、3次(T3)的磁化水和普通水(CK)制備 YMA 培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中(裝液量80 mL/250 mL)，每處理重復(fù)3次。高壓蒸汽滅菌后，接種活化后的根瘤菌種子液(接種量 1 %)，置于恒溫?fù)u床中 120 r·min-1，30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。每隔 8 h分別測定各處理根瘤菌的生長狀況。測定各處理培養(yǎng)液的 OD600nm值，同時(shí)用稀釋平板測數(shù)法測定根瘤菌活菌數(shù)。按10 ×倍比對(duì)各處理培養(yǎng)液梯度稀釋后，取 200 μL 合適稀釋度的稀釋液均勻涂布于 YMA 平板上，于恒溫培養(yǎng)箱中 30 ℃倒置培養(yǎng) 48 h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算活菌數(shù)。

活菌數(shù)(cfu·mL-1)培養(yǎng)液=計(jì)數(shù)皿菌平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種量

1.6 磁化水灌溉對(duì)苜蓿接種根瘤菌結(jié)瘤數(shù)的影響

1.6.1 接種液的制備 將根瘤菌S.melilotiXGL026-GFP 菌株活化后，接種至由 T1、T2、T3 磁化水和普通水配制的 YMA 液體培養(yǎng)基中(含四環(huán)素 10 μg·mL-1)，120 r·min-1，30 ℃，振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm≈1.0。

1.6.2 盆栽苜蓿接種根瘤菌 將土壤和蛭石混和(體積比 1∶1)滅菌后，按每盆15 kg 干土裝入花盆中，其底部放置托盤接滲漏液，防止養(yǎng)分、水分流失。將供試苜蓿種子表面消毒后催芽，選取露白均勻一致種子，按每粒200 μL接種菌液。每盆播種 5 粒種子，出苗后每盆選留生長一致的 3 株苗，每處理 14 盆苗。將花盆放置在日光溫室內(nèi)，自然光照，適時(shí)澆水。

1.6.3 磁化水灌溉 對(duì)各接種處理分別用 T1、T3 磁化水灌溉接種處理的苜蓿盆栽苗，以無菌水灌溉接種處理的苜蓿盆栽苗作為對(duì)照，每處理 7 盆。50 d 后調(diào)查苜蓿結(jié)瘤情況。

1.7 磁化水對(duì)枯草芽孢桿菌生長的影響

分別用4 000 Gs 磁化處理 1次(T1)、2次(T2)、3 次(T3)的磁化水和20 000 Gs磁化處理1次(T4) 的磁化水和普通水(CK)制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中(裝液量80 mL/250 mL)，每處理重復(fù)3次。滅菌后，接種活化后的根瘤菌種子液(接種量1 %)，置于恒溫?fù)u床中 120 r·min-1，30 ℃ 振蕩培養(yǎng)48 h。每隔 8 h 分別測定各處理根瘤菌培養(yǎng)液的OD600nm值和活菌數(shù)。

1.8 磁化水培養(yǎng)的枯草桿菌對(duì)棉花黃萎菌的抑菌效果

1.8.1 棉花黃萎菌孢子液的制備 將黃萎菌活化后, 挑取菌塊接種于察氏液體培養(yǎng)基中，180 r·min-1，25 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)5～7 d，4層紗布過濾菌絲, 在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板將濾液中孢子數(shù)調(diào)至1×106個(gè)·mL-1。

1.8.2 枯草芽孢桿菌對(duì)棉花黃萎病菌抑菌活性的測定 用 PDA 培養(yǎng)基制備雙層平板。取黃萎病菌孢子懸液200 μL均勻涂布平板，用滅菌的打孔器在培養(yǎng)基平板周圍打孔(直徑為 5 mm)。向孔洞內(nèi)分別加入20 μL磁化水和普通水培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌接種液，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)3～4 d。觀察抑菌圈產(chǎn)生情況。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2003 和 SPSS 19.0 軟件對(duì)試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁化水處理對(duì)苜蓿根瘤菌S.meliloti XGL026生長的影響

用磁化水和普通水制備的培養(yǎng)基培養(yǎng)苜蓿根瘤菌S.melilotiXGL 026，定期檢測根瘤菌菌液濃度及活菌數(shù)的動(dòng)態(tài)變化(圖 1、圖 2)。結(jié)果表明，在普通水培養(yǎng)基中，接種后培養(yǎng)8 h的菌體濃度迅速增長至OD值0.320，48 h后達(dá)到最高生長量(OD600nm=1.534)。在4 000 Gs 磁化 1 次(T1)、 2 次(T2)、3次(T3)的磁化水培養(yǎng)基中，菌體生長更為迅速，培養(yǎng)8 h的菌液OD值分別達(dá)0.674、0.923、1.730。T1、T2磁化水培養(yǎng)至48 h 時(shí)菌體濃度達(dá)到最高，OD值分別為1.810、

圖1 磁化水處理對(duì)根瘤菌菌液濃度的影響Fig.1 Effect of magnetized water treatment on theconcentration of S.meliloti XGL026

圖2 磁化水處理對(duì)根瘤菌活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of magnetized water on the viablebacteria counts of S.meliloti XGL026

1.900，T3處理達(dá)到菌體最高生長量的時(shí)間提前至32 h(OD600nm=2.016)。磁化水對(duì)枯草桿菌活菌數(shù)影響的測定結(jié)果與菌液濃度變化相符合。由圖2可見，在磁化水培養(yǎng)基中，根瘤菌生長繁殖速度加快，0～48 h的培養(yǎng)周期中活菌數(shù)均高于普通水對(duì)照。培養(yǎng)48 h時(shí)，T1處理和普通水對(duì)照活菌數(shù)均達(dá)到最高值，T1較對(duì)照增加11.02%；T2、T3處理在40 h時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最高值，較對(duì)照分別提高76.92%、72.47%。

2.2 磁化水對(duì)苜蓿根瘤菌結(jié)瘤的影響

在盆栽苜蓿上接種由綠色熒光蛋白基因GFP標(biāo)記的根瘤菌株S.melilotiXGL 026-GFP，以磁化水或普通水灌溉，定期檢測其在苜蓿根上的結(jié)瘤數(shù)(表1)。結(jié)果表明，接種磁化水培養(yǎng)的根瘤菌能顯著增加苜蓿結(jié)瘤數(shù)(P<0.05)，各處理的結(jié)瘤數(shù)每株增加 5～11 個(gè)(平均8個(gè))，其中接種 T3 磁化水培養(yǎng)的根瘤菌+T3磁化水灌溉苜蓿處理(T3培養(yǎng)+T3磁化水灌溉)的結(jié)瘤數(shù)增幅最顯著(P<0.01)。接種后采用磁化水澆灌的苜蓿結(jié)瘤數(shù)略高于用普通水澆灌，但差異不大(P>0.05)。

表1 磁化水處理對(duì)苜蓿結(jié)瘤數(shù)的影響Table 1 Effect of magnetized water on the nodule number of alfalfa

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note:Different lowercase letters on the table indicate significant difference at the 0.05 level,different capital letters indicate significant difference at the 0.01 level.The same below.

2.3 磁化水對(duì)生防枯草桿菌B.subtilis 2-4菌株生長的影響

測定生防枯草桿菌在磁化水培養(yǎng)基中菌體濃度和活菌數(shù)的動(dòng)態(tài)變化(圖3，圖4)。結(jié)果表明，在普通水培養(yǎng)基中，接種后培養(yǎng)8 h的菌體濃度迅速增長至OD值0.833，24 h后即達(dá)到最高生長量(OD600nm=1.816)；而4 000 Gs 磁化 1次(T1)、 2次(T2)、3次(T3)和20 000 Gs磁化 1 次(T4)的磁化水培養(yǎng)基中，菌體濃度增長遲緩，培養(yǎng)8 h的OD值依次為0.483、0.189、0.234和0.221，達(dá)到菌體最高生長量的時(shí)間延遲到32 h，OD值分別為1.754、1.83、1.437和1.256，說明T1、T2磁化水在枯草桿菌生長前期對(duì)菌體生長繁殖具有一定抑制作用，但隨著生長期延長抑制作用減弱，對(duì)菌體生長量的影響不大。T3、T4處理則對(duì)枯草桿菌的整個(gè)生長期都有明顯的抑制作用，并顯著降低其生長量，其中T4處理達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。磁化水對(duì)枯草桿菌活菌數(shù)影響的測定結(jié)果也顯示相似的特點(diǎn)。由圖4可見，在磁化水培養(yǎng)基中，接種后培養(yǎng)8 h的枯草桿菌增長速度較普通水降低。培養(yǎng)32 h后活菌數(shù)達(dá)到最高值，T1、T2處理較對(duì)照增加6.48%、8.48%，但T3和T4較對(duì)照降低33.17%和93.52%。

2.4 磁化水處理對(duì)枯草芽孢桿菌B.subtilis 2-4菌株抑菌效果的影響

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)枯草芽孢桿菌生長有促進(jìn)作用的T1處理和有顯著抑制作用的 T3、T4處理，測定其對(duì)棉花黃萎菌抑菌效果的影響(表2)。從表2可以看出，與普通水對(duì)照相比，T1磁化水處理能提高枯草桿菌的抑菌作用，抑菌圈半徑較對(duì)照增大。而T3和T4磁化水處理，其抑菌圈半徑較對(duì)照分別減小44.5%和49.6%，對(duì)棉花黃萎菌的抑菌效果顯著減弱(P<0.01)。

圖3 磁化水對(duì)枯草桿菌2-4細(xì)胞濃度的影響Fig.3 Effect of magnetized water on the cellconcentration of B.subtilis 2-4

圖4 磁化水對(duì)枯草桿菌2-4活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of magnetized water on the visablebacteria counts of B.subtilis 2-4

處理Treatment抑菌圈半徑/mmTheantibacterialcircleradius普通水對(duì)照 Theordinarywater(CK)17．19±0．008cC4000Gs磁化1次(T1) 4000Gsmagnetizationforonetime(T1)17．32±0．001cC4000Gs磁化3次(T3) 4000Gsmagnetizationforthreetimes(T3)9．54±0．001bB20000Gs磁化1次(T4) 20000Gsmagnetizationforonetime(T4)8．66±0．001aA

3 討論及結(jié)論

3.1 磁化水處理對(duì)苜蓿根瘤菌的生物效應(yīng)

根瘤菌與豆科植物共生結(jié)瘤是自然界中最高效的固氮體系，對(duì)植物氮素營養(yǎng)的持續(xù)供給、土壤改良、土壤肥力的提高和保持起到舉足輕重的作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。筆者[20]前期的試驗(yàn)結(jié)果證明，20 000 Gs恒定磁場處理的磁化水對(duì)苜蓿根瘤菌生長有顯著的抑制作用，活菌數(shù)減少至普通水培養(yǎng)基的86.96%～65.72%，20 000 Gs磁化3次的處理抑制效果達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。本研究結(jié)果表明，4 000 Gs 磁場強(qiáng)度下磁化1～3次的磁化水對(duì)苜蓿根瘤菌生長有明顯促進(jìn)作用，增加其菌體濃度，最大生長量較對(duì)照增加11.02%～76.92%(平均43.97%)，磁化2次、3次的處理縮短了到達(dá)最高活菌數(shù)的時(shí)間。磁化水不僅影響根瘤菌生長，還會(huì)對(duì)其在土壤中的定殖、侵染結(jié)瘤和固氮效率產(chǎn)生影響。何媛等[20]發(fā)現(xiàn)采用20 000 Gs 恒定磁場的磁處理水灌溉，接種根瘤菌在苜蓿根部土壤的存活、定殖量下降，單株結(jié)瘤數(shù)較對(duì)照平均減少46.4%(P<0.01)，地上、地下部分的固氮率分別降低21.06%和20.48%，固氮量分別降低26.64%和37.50%[23]。本研究通過苜蓿盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種由4 000 Gs的磁處理水培養(yǎng)的根瘤菌能顯著增加苜蓿結(jié)瘤數(shù)(P<0.05)，磁化3次處理的增加幅度最大。研究結(jié)果明確了不同磁場強(qiáng)度下的磁化水對(duì)苜蓿根瘤菌產(chǎn)生的效應(yīng)差異極大，20 000 Gs的較“高”磁場強(qiáng)度磁處理水對(duì)根瘤菌的生長及存活定殖、結(jié)瘤和固氮均產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)，而4 000 Gs的較“低”磁場強(qiáng)度下的磁處理水則對(duì)苜蓿根瘤菌的生長、結(jié)瘤有明顯的促進(jìn)作用。4 000 Gs的磁處理水對(duì)苜蓿根瘤菌的田間固氮效應(yīng)及對(duì)苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)的影響將在今后進(jìn)一步試驗(yàn)研究。大量研究表明，利用優(yōu)良根瘤菌株接種是苜蓿高效生產(chǎn)的重要舉措，而接種根瘤菌在土壤中的存活、穩(wěn)定定殖和高效結(jié)瘤是發(fā)揮其固氮效能的關(guān)鍵。目前，對(duì)根瘤菌的應(yīng)用研究均在常規(guī)灌溉模式下進(jìn)行，對(duì)磁化水灌溉條件下根瘤菌的應(yīng)用研究鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果為在磁化水灌溉條件下苜蓿生產(chǎn)中應(yīng)用根瘤菌提供了參考。

3.2 磁化水處理對(duì)枯草芽孢桿菌的生物效應(yīng)

枯草芽孢桿菌為好氧產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，具有顯著的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，是一種理想的生防細(xì)菌資源，被廣泛研究和商業(yè)化生產(chǎn)，目前已在黃瓜、辣椒、水稻、小麥、玉米、棉花等多種農(nóng)作物病害防治中得到成功的應(yīng)用。謝捷等[21]發(fā)現(xiàn)，磁場強(qiáng)度為 500 Gs 的磁處理水對(duì)枯草桿菌生長有一定促進(jìn)作用，但1 000 Gs、2 500 Gs的磁處理水對(duì)枯草桿菌的生長有極明顯的抑制作用(P<0.01)，而800 Gs 的磁處理水對(duì)枯草芽孢桿菌的生長沒有影響。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4 000 Gs 、20 000 Gs的磁處理水對(duì)枯草桿菌的生長速度具有不同程度的抑制作用，其中4 000 Gs 磁化 3 次和20 000 Gs磁化 1 次的磁處理水可顯著降低其生長量。本試驗(yàn)得出的抑制和促進(jìn)枯草桿菌的磁處理水的磁場強(qiáng)度與謝婕等[21]的結(jié)果有較大區(qū)別，可能是供試菌株不同，磁化條件不同，故所得結(jié)論也不盡相同。宋健等[22]發(fā)現(xiàn)，28～50 Gs 的磁處理水可以提高蘇云金芽孢桿菌G-02菌株的產(chǎn)孢量，43 Gs磁場處理2～12 h 的磁化水培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大、毒力效果增強(qiáng)[22]。適當(dāng)磁化強(qiáng)度的磁化水能顯著提高綠僵菌液生分生孢子產(chǎn)量，但磁化水生產(chǎn)的分生孢子液對(duì)馬尾松毛蟲的毒力與普通水對(duì)照并無顯著差異[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，4 000 Gs磁化1次磁處理水對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌能力有一定增效作用，4 000 Gs磁化3次和20 000 Gs磁化1次的磁處理水培養(yǎng)的枯草桿菌對(duì)棉花黃萎菌的抑菌效果顯著減弱(P<0.01)。本研究僅開展了室內(nèi)試驗(yàn)，磁化水能否對(duì)枯草桿菌2-4菌株田間防病效果產(chǎn)生影響，還需后續(xù)的盆栽、小區(qū)和大田試驗(yàn)做進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)不同物理特性的磁場，如磁場強(qiáng)弱、作用時(shí)間、磁化次數(shù)(頻率)、原水水質(zhì)以及水的流速等諸多因素都會(huì)影響磁化水的性質(zhì)，針對(duì)不同的微生物菌株所起引的生物學(xué)效應(yīng)具有很大差異[24]。磁化水的生物效應(yīng)是磁場和生物共同作用的結(jié)果，其過程十分復(fù)雜。目前磁化水對(duì)微生物生物效應(yīng)的研究還十分有限，其機(jī)理至今仍處于假設(shè)和論證階段，尚無定論。今后很有必要對(duì)磁化水的作用機(jī)制做進(jìn)一步的深入探討和研究，為磁化水的應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

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