曹亞松，王春生，李海源，徐小鴻，商文靜，楊家榮，胡小平

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植保學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)屬半知菌類(lèi)輪枝孢屬真菌，寄主范圍廣泛，能危害660多種植物，其中農(nóng)作物184種[1]，且其寄主范圍還在繼續(xù)擴(kuò)大[2]。微菌核是大麗輪枝菌在土壤中的主要存活結(jié)構(gòu)，是黃萎病的主要初侵染來(lái)源[3-4]。大麗輪枝菌微菌核具有很強(qiáng)的抗逆性，可以在沒(méi)有寄主存在的條件下在土壤中存活14 a[5]，這與其含有豐富的黑色素密切相關(guān)[6]。

黑色素是由吲哚類(lèi)或酚類(lèi)物質(zhì)氧化聚合而形成的一種帶有負(fù)電荷的疏水性生物大分子物質(zhì)[7]。黑色素增加真菌對(duì)紫外照射[8-10]、酶解[11]以及極端溫度的抗性[8,12]。黑色素還影響真菌的致病力，在甘藍(lán)鏈格孢中與致病力有關(guān)的基因中就包括幾類(lèi)黑色素合成必需的基因[13]。水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、瓜類(lèi)炭疽病菌(Colletotrichumlagenarium)、菜豆炭疽病(Colletotrichumlindemuthianum)和禾生炭疽病菌(Colletotrichumgraminicola)等侵入寄主均需要黑色素的參與，黑色素缺失突變菌株喪失穿透寄主表皮的能力[14-15]。

漆酶是黑色素合成途徑的一種關(guān)鍵酶，它不僅可以催化DHN-黑色素的合成，也可以催化DOPA-黑色素的合成[7]。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶與抗壞血酸氧化酶，與哺乳動(dòng)物血漿銅藍(lán)蛋白同源，都屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族[16]，最早是由日本學(xué)者Yoshida[17]從日本紫膠漆樹(shù)(Rhusverniciflua)漆液中發(fā)現(xiàn)的。漆酶廣泛分布于植物、真菌、昆蟲(chóng)和細(xì)菌中[18]，它能夠催化一系列有機(jī)(尤其是芳香族)或無(wú)機(jī)化合物的氧化反應(yīng)[7]。漆酶在真菌中起到多種作用，比如形態(tài)發(fā)生、壓力防御、致病力以及木質(zhì)素降解等[19-21]。Lv等[22]研究表明，Scleromitrulashiraiana中的Sh-lac基因參與菌絲生長(zhǎng)和黑色素合成，且有可能與致病力相關(guān)。Duressa等[23]用RNA-seq的方法分析大麗輪枝菌微菌核形成過(guò)程中基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)編碼漆酶的 VDAG_00189基因在微菌核形成過(guò)程中表達(dá)量較高，但該基因在大麗輪枝菌中的生物學(xué)功能仍不清楚。

本研究以大麗輪枝菌JY菌株DNA為基礎(chǔ)，通過(guò)基因克隆技術(shù)獲得 VDAG_00189基因的序列，構(gòu)建敲除質(zhì)粒和互補(bǔ)質(zhì)粒，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(ATMT)[24-25]和PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法[25-26]對(duì) VDAG_00189進(jìn)行基因敲除和功能回復(fù)，得到敲除突變體 △VdLac-52、 △VdLac-54、 △VdLac-59、 △VdLac-61和互補(bǔ)突變體 △VdLac-C。通過(guò)觀(guān)察突變體和野生型的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速率、壓力敏感以及致病力等功能變化，來(lái)了解該基因在黑色素合成和致病等過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及載體

pA-Hyg-OSCAR(攜帶潮霉素抗性質(zhì)粒)和pOSCAR(骨架質(zhì)粒)購(gòu)自真菌遺傳保藏中心(www.fgsc.net)。大腸桿菌DH5α購(gòu)自TaKaRa公司。大麗輪枝菌涇陽(yáng)菌株JY、棉花感病品種‘冀棉11’和農(nóng)桿菌菌株EH105由西北農(nóng)林科技大學(xué)土傳病害實(shí)驗(yàn)室提供。大腸桿菌DH10B和構(gòu)建互補(bǔ)質(zhì)粒所需的酵母菌株XK1-25(Trp營(yíng)養(yǎng)缺陷型)、穿梭載體pFL2(含有GFP和Trp合成基因)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)許金榮教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基及緩沖液

試驗(yàn)用到的培養(yǎng)基有PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基[27]、Czapek(查氏)培養(yǎng)基、YEPD培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、TB3培養(yǎng)基、SD-Trp培養(yǎng)基、STC buffer。培養(yǎng)基中抗生素和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度分別為潮霉素(Hyg) 50 mg·L-1、頭孢霉素(Cef) 200 mg·L-1、利福平(Rif) 50 mg·L-1、氨芐青霉素(Amp) 50 mg·L-1、G418 100 mg·L-1。

1.3 基因克隆和生物信息學(xué)分析

在NCBI網(wǎng)站搜索VdLac( VDAG_00189)基因的氨基酸序列，使用BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearc&LINK_LOC=blasthome)程序在nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性搜索，選取同源的真菌蛋白序列，用MEGA 6.0軟件以鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建及敲除突變體的篩選

以VdLac基因序列為敲除片段，設(shè)計(jì)引物。以野生型菌株JY基因組DNA為模板，擴(kuò)增VdLac基因上游的1 043 bp序列片段和下游的908 bp序列片段，通過(guò)一步法[28]將基因的上、下游片段和潮霉素基因連接到骨架質(zhì)粒pOSCAR上，構(gòu)建敲除質(zhì)粒pOSCAR-Lac。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建好的敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生型菌株JY中，經(jīng)過(guò)潮霉素(50 mg·L-1)抗性篩選，以及潮霉素基因檢測(cè)引物Hyg-F和Hyg-R目的基因檢測(cè)引物L(fēng)ac-F和Lac-R對(duì)敲除轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證(表1)，得到該基因的敲除突變體。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

注：Lac-UF、Lac-UR、Lac-DF和Lac-DR引物中帶有下劃線(xiàn)的序列表示載體構(gòu)建時(shí)添加到每個(gè)引物5′端的attB重組序列[28]；Lac-CF和Lac-CR引物中帶有下劃線(xiàn)的序列代表載體構(gòu)建時(shí)添加的XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)兩端的同源序列。

Note:Underlined text in primer sequences of Lac-UF, Lac-UR, Lac-DF and Lac-DR indicate the attB recombination sequence added to the 5′end of primers[28]; underlined text in primer sequences of Lac-CF and Lac-CR represent the added homologous sequences to both ends of the restriction enzyme cutting sites ofXhoⅠ.

1.5 敲除突變體的功能回復(fù)

以野生型JY菌株基因組DNA為模板，利用Lac-FC和Lac-RC引物，擴(kuò)增VdLac基因上游序列和編碼序列并連接到質(zhì)粒pFL2上，構(gòu)建互補(bǔ)質(zhì)粒pFL2-Lac。采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，將互補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化敲除突變體得到互補(bǔ)突變體，經(jīng)過(guò)G418抗性篩選和表型測(cè)定，并使用目的基因檢測(cè)引物L(fēng)ac-F和Lac-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到該基因的互補(bǔ)突變體。

1.6 菌落形態(tài)及菌落生長(zhǎng)速率的測(cè)定

在培養(yǎng)7 d的野生型JY菌株，敲除突變體 △VdLac-52、 △VdLac-59、 △VdLac-61菌株以及互補(bǔ)突變體 △VdLac-C菌株的菌落邊緣打菌餅(d=7 mm)，分別接種到CM平板中央，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)20 d后觀(guān)察菌落特征，并在菌落生長(zhǎng)的第5、10、15和20天，用“十字”交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3個(gè)皿，重復(fù)3次。

1.7 產(chǎn)孢量測(cè)定

以野生型JY菌株為對(duì)照，配制濃度為1×107mL-1的敲除突變體 △VdLac-52、 △VdLac-59、 △VdLac-61菌株和互補(bǔ)突變體 △VdLac-C菌株的孢子懸浮液。吸取200 μL孢子懸浮液，接種至裝有50 mL Czapek的液體培養(yǎng)基中，于25 ℃條件下120 r·min-1黑暗搖培7 d后，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量孢子懸浮液濃度。重復(fù)3次。

1.8 壓力敏感性測(cè)定

在培養(yǎng)7 d的野生型、敲除突變體以及互補(bǔ)突變體的菌落邊緣打菌餅(d=7 mm)，分別接種到含有H2O2(w=0.03%)(氧化壓力)、20 μm·mL-1SDS(細(xì)胞壁壓力)、1.2 mol·L-1山梨醇(滲透壓力)、NaCl(鹽脅迫)(0.7 mol·L-1、1.5 mol·L-1)、5 mmol·L-1NaNO2(硝化壓力)、10 mmol·L-1EDTA·Na2(螯合劑壓力)、CuSO4(重金屬脅迫)(250 μmol·L-1、500 μmol·L-1、1 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1、5 mmol·L-1)的CM平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)20 d后觀(guān)察菌落特征，并分別在菌落生長(zhǎng)的第5、10、15和20天用“十字”交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.9 漆酶顯色反應(yīng)

參考Shin等[29]的方法，利用ABTS作為漆酶的特異性底物，將野生型菌株、敲除突變體菌株和互補(bǔ)突變體的菌餅(d=7 mm)分別接種在含有0.3 g·L-1ABTS和3 g·L-1KNO3的CM和Czapek培養(yǎng)基平板中心，25 ℃黑暗培養(yǎng)10 d。每隔2 d觀(guān)察一次培養(yǎng)基顏色變化情況。每個(gè)處理3個(gè)皿，重復(fù)3次。

1.10 致病力測(cè)定

野生型及突變體菌株的接種方法參照水培棉花孢子懸浮液浸根接種法[30]。待棉花幼苗長(zhǎng)到2片真葉平展時(shí)，將棉苗小心取出，用清水清洗干凈，浸在孢子濃度為3×106mL-1的懸浮液中30 min，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照。接種21 d后，采用5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[31]記錄發(fā)病級(jí)別。病害調(diào)查的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下。

0級(jí)：棉株健康，無(wú)病葉，生長(zhǎng)正常；1級(jí)：棉株1/4以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；2級(jí)：棉株1/4以上、1/2以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫； 3級(jí)：棉株1/2以上、3/4以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；4級(jí)：3/4以上葉片發(fā)病，或葉片全部脫落，棉株枯死。

病情指數(shù)=[∑各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)病級(jí)/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí))]×100

1.11 數(shù)據(jù)分析

采用SAS(Statistical Analysis System)8.1軟件的TTEST和ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 VdLac蛋白的生物信息學(xué)分析

根據(jù)NCBI上已公布的大麗輪枝菌VdLs.17的基因組序列，克隆得到 VDAG_00189序列，該基因全長(zhǎng)1 978 bp，cDNA序列全長(zhǎng)1 713 bp，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，編碼570個(gè)氨基酸，將其命名為漆酶。將VdLac基因編碼的氨基酸序列提交NCBI進(jìn)行BLASTP同源性比對(duì)，分析表明該漆酶與已知的Verticilliumalfalfae的親緣關(guān)系最近，同源性為96%(圖1)。

2.2 敲除及互補(bǔ)突變體的獲得

提取從潮霉素(Hyg)抗性平板上篩選到的敲除轉(zhuǎn)化子DNA和從G418抗性平板上篩選到的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子DNA，用Hyg基因的特異引物Hyg-F和Hyg-R、目的基因特異引物L(fēng)ac-F和Lac-R進(jìn)行PCR檢測(cè)。4個(gè)敲除突變體都能擴(kuò)增得到大小為896 bp的Hyg基因條帶，而野生型菌株JY沒(méi)有相應(yīng)條帶(圖2-A)；從敲除突變體中均無(wú)法擴(kuò)增得到目的基因條帶，而JY和互補(bǔ)突變體 △VdLac-C能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶(圖2-B)。選取其中3個(gè)敲除突變體進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 突變體及野生型菌株的產(chǎn)孢量和致病力測(cè)定

在Czapek液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，3個(gè)突變體的產(chǎn)孢量與野生型及互補(bǔ)突變體間無(wú)顯著差異(數(shù)據(jù)略)。接種棉花21 d后，突變體與野生型接種的植株表現(xiàn)出典型的黃萎病癥狀，但病情指數(shù)無(wú)顯著差異(數(shù)據(jù)略)。說(shuō)明VdLac基因不影響菌株的產(chǎn)孢及致病力。

2.4 突變體和野生型菌株的生長(zhǎng)速率和壓力敏感性測(cè)定

在CM平板中培養(yǎng)20 d后，3個(gè)敲除突變體 與野生型和互補(bǔ)突變體在培養(yǎng)基的顏色都為黑色(數(shù)據(jù)略)。敲除突變體 △VdLac-52、 △VdLac-59、 △VdLac-61與野生型JY和互補(bǔ)突變體 △VdLac-C在CM平板上培養(yǎng)20 d后，其生長(zhǎng)速率間無(wú)明顯差異；而在含有5 mmol·L-1NaNO2的CM平板上，3個(gè)突變體的菌落直徑明顯小于野生型及互補(bǔ)突變體的菌落直徑；H2O2(w=0.03%)、1.2 mol·L-1山梨醇、10 mmol·L-1EDTA·Na2和NaCl(0.7 mol·L-1、1.5 mol·L-1)對(duì)突變體和野生型的菌絲生長(zhǎng)雖都有抑制作用，但抑制效果不明顯(表2)。此外，20 μg·mL-1SDS和CuSO4(250 μmol·L-1、500 μmol·L-1、1 mmol·L-1)對(duì)敲除突變體和野生型以及互補(bǔ)突變體的生長(zhǎng)均無(wú)抑制作用，當(dāng)CuSO4濃度為2.5 mmol·L-1和5 mmol·L-1時(shí)，敲除突變體、野生型和互補(bǔ)突變體均不能生長(zhǎng)(表2)。

圖1 大麗輪枝菌 VdLac漆酶蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of VdLac of Verticillium dahliae

A：Hyg基因的PCR擴(kuò)增 Amplification ofHyggene by PCR; M.D 2000 marker；1-4.敲除突變體 Deletion mutants △VdLac-52、 △VdLac-54、 △VdLac-59、 △VdLac-61；5.pA-Hyg-OSCAR質(zhì)粒 pA-Hyg-OSCAR plasmid；6.JY；7.無(wú)菌水Sterile water

B:目的基因VdLac的PCR擴(kuò)增 Amplification ofVdLacgene by PCR; M.D 2000 marker；1-4.敲除突變體 Deletion mutants △VdLac-52、 △VdLac-54、 △VdLac-59、 △VdLac-61；5. △VdLac-C；6.JY；7.無(wú)菌水 Sterile water

圖2 △VdLac突變體的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR detection of △VdLac mutants

注：數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”。所有菌株均在CM培養(yǎng)基中黑暗條件下25 ℃，培養(yǎng)20 d后測(cè)量菌落直徑。所有菌株均與野生型進(jìn)行比較。同行數(shù)據(jù)不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05的水平上有差異；同行數(shù)據(jù)不同大寫(xiě)字母表示在P<0.01的水平上有差異。

Note：Data in the table are “Average±SE”.All the strains were cultivated at 25 ℃ in dark on CM plates.The colony diameters were measured at 20d after inoculation.All the strains were compared with wild type strain.Different lowercase letters in each row mean significant difference at the level ofP<0.05; Different uppercase letters in each row mean significant difference at the level ofP<0.01.

2.5 漆酶顯色反應(yīng)

敲除突變體 △VdLac-52、 △VdLac-59、 △VdLac-61和野生型JY及互補(bǔ)突變體 △VdLac-C在含有ABTS的CM培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，菌落邊緣可以觀(guān)察到藍(lán)色的漆酶顯色圈，但野生型和互補(bǔ)突變體的顯色圈明顯比敲除突變體的大，說(shuō)明敲突變體在CM培養(yǎng)基上仍然可以產(chǎn)生漆酶，但漆酶的含量較低；而在查氏培養(yǎng)基上，所有的菌株都未產(chǎn)生顯色圈(圖3)。

所有菌株均接種在含有0.3 g·L-1ABTS和3 g·L-1KNO3的CM(上圖)和Czapek(下圖)平板上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)10 d。

All the strains grow on CM(above) and Czapek(below) plates containing 0.3 g·L-1ABTS and 3 g·L-1KNO3at 25 ℃ in dark for 10 d.

圖3突變體及野生型菌株在CM和Czapek培養(yǎng)基上的漆酶顯色反應(yīng)
Fig.3ThechromogenicreactionoflaccaseinmutantsandwildtypestrainonCMandCzapekplates

3 討 論

真菌漆酶具有各種各樣的功能，包括木質(zhì)素降解、色素合成、子實(shí)體形成、解毒作用、形態(tài)發(fā)生以及致病力[32]。構(gòu)巢曲霉和煙曲霉中的漆酶在分生孢子發(fā)育和萌發(fā)過(guò)程參與色素的生成[33]。馬爾尼菲青霉中編碼漆酶的pbrB基因?qū)Ψ稚咦覦HN-黑色素的合成是必須的[7]。西瓜炭疽病菌的 △Lac1突變體黑色素含量略有減少、漆酶酶活卻有所升高，而 △Lac2突變體黑色素含量下降、分生孢子顏色變淺并喪失致病力[34-35]。然而，本研究結(jié)果表明，大麗輪枝菌的VdLac基因不影響菌株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)(表2)、產(chǎn)孢、以及致病力(數(shù)據(jù)略)。本研究也檢測(cè)突變體及野生型菌株對(duì)不同壓力的敏感性，發(fā)現(xiàn)突變體對(duì)NaNO2敏感(表2),說(shuō)明VdLac基因編碼的漆酶能保護(hù)菌株免受硝化壓力的傷害。

植物病原真菌產(chǎn)生多基因編碼的漆酶同工酶[36]。擔(dān)子菌Trametesgallica中存在2個(gè)漆酶基因，子囊菌Podosporaanserina中存在3個(gè)漆酶基因，白腐菌Physisporinusrivulosus中存在4個(gè)漆酶基因，擔(dān)子菌Coprinopsiscinerea中存在8個(gè)漆酶基因[37-40]。大麗輪枝菌中鑒定得到6個(gè)編碼漆酶的基因，其中本研究用到的 VDAG_00189(VdLac)基因在微菌核形成過(guò)程中上調(diào)表達(dá)[41]。本研究中 △VdLac與野生型相比菌落顏色和形態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯變化(數(shù)據(jù)略)；漆酶顯色反應(yīng)表明 △VdLac仍然存在漆酶活性，但含量降低(圖3)。由此推測(cè)大麗輪枝菌VdLac基因不參與DHN 黑色素的合成。但大麗輪枝菌中其他漆酶基因是否參與黑色素的合成，在黑色素合成過(guò)程中不同漆酶基因之間是否存在協(xié)同或補(bǔ)充作用，還需要通過(guò)單基因以及多基因敲除進(jìn)行深入研究。

在植物病原真菌漆酶產(chǎn)生篩選過(guò)程中，根據(jù)病原菌在含有ABTS的基本培養(yǎng)基平板上的顯色情況可以估計(jì)產(chǎn)漆酶活性，通過(guò)顯色圈與菌落直徑的相對(duì)差值，以及顏色深淺可用于初步估計(jì)產(chǎn)漆酶量的高低[42]。本研究表明，在含有ABTS的CM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，野生型菌株的顯色圈明顯大于缺失突變體的(圖3)，說(shuō)明 △VdLac的漆酶含量降低。并且缺失突變體和野生型菌株在含有ABTS的CM和Czapek培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出顯色差異(圖3)。Shleev等[43]在研究中發(fā)現(xiàn)，同一種病原菌在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)漆酶活力差異很大，特別是培養(yǎng)基組中的碳和氮源是影響真菌漆酶產(chǎn)量的重要因素[44]，糙皮側(cè)耳菌Pleurotusostreatus漆酶活性隨葡萄糖濃度的增加而增加[45]；有機(jī)氮比無(wú)機(jī)氮更利于疣孢漆斑菌MyrotheciumverrucariaNF-05菌株產(chǎn)漆酶[44]。本試驗(yàn)中，CM培養(yǎng)基與Czapek培養(yǎng)基的配方相比，主要是碳源與氮源不同，CM培養(yǎng)基的碳源是葡萄糖，而Czapek培養(yǎng)基則是蔗糖，CM培養(yǎng)基的氮源除無(wú)機(jī)氮外還有酵母提取物，酸水解酪蛋白和蛋白胨。推測(cè)可能是葡萄糖、酵母提取物、酸水解酪蛋白或蛋白胨能刺激大麗輪枝菌產(chǎn)生漆酶。

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