王 令，李 佼，席彥軍，吳軍艦，郭明星，李秀峰，張 羽

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000；2.陜西省漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西漢中 723000)

茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]屬山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)，起源于中國西南地區(qū)，作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，其已有3 000多年的栽培歷史[1]。茶樹種質(zhì)資源是茶樹遺傳改良、種質(zhì)創(chuàng)新等工作的物質(zhì)基礎(chǔ)，開展茶樹種質(zhì)資源遺傳研究，對收集利用優(yōu)異茶樹種質(zhì)資源和促進(jìn)茶葉科技創(chuàng)新具有重要意義[2]。陜西茶區(qū)毗鄰古茶樹發(fā)源地四川，歷經(jīng)千年的自然演化和人工栽培，擁有豐富的茶樹種質(zhì)資源，根據(jù)20世紀(jì)80年代的資源調(diào)查結(jié)果，陜西茶樹地方品種大體分為7大群體和28個品種[3]。但早期分類主要依據(jù)地域、栽培歷史和茶樹形態(tài)等宏觀指標(biāo)，缺乏生理生化和分子遺傳等微觀水平研究，利用分子標(biāo)記技術(shù)深入了解地方茶樹遺傳背景和親緣關(guān)系，為茶樹分類和種質(zhì)創(chuàng)新等研究提供技術(shù)支撐。

SCoT(start codon targeted polymorphism)分子標(biāo)記是根據(jù)植物基因中的起始密碼子(ATG)側(cè)翼序列具有較高保守特性，設(shè)計單引物對基因組進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)的顯性多態(tài)性標(biāo)記。該技術(shù)具有操作簡便、多態(tài)信息豐富、成本低廉、引物通用性廣等諸多優(yōu)點(diǎn)，已在油菜、柑橘、西瓜和柿等多種植物中建立了PCR體系并成功開展遺傳研究[4-8]。陳熙等[9]首次利用SCoT標(biāo)記分析了部分陜西茶樹遺傳背景，但未對SCoT-PCR體系做優(yōu)化試驗(yàn)。本研究通過優(yōu)化SCoT-PCR體系，建立茶樹SCoT標(biāo)記技術(shù)，并分析‘陜茶一號’及其他陜西地方群體茶樹材料的遺傳背景和親緣關(guān)系，為茶樹資源遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試茶樹品種為‘陜茶一號’。其余21份茶樹品種來自本地群體種資源圃(表1)。供試材料取自陜西省漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所茶葉綜合試驗(yàn)站，選取無病蟲害、幼嫩的茶樹1芽1葉，-80 ℃保存。

試驗(yàn)所用SCoT引物由北京奧科生物公司合成，TaqDNA聚合酶和DNA提取試劑盒購于大連寶生物工程有限公司。

1.2 DNA提取與檢測

采用DNA提取試劑盒提取茶葉DNA，加TE緩沖液保存。用紫外分光光度計檢測DNA純度和質(zhì)量濃度，稀釋至50 ng/μL。采用8 g/L的瓊脂糖凝膠檢測茶葉基因組DNA。

表1 本研究所用試驗(yàn)材料Table 1 Materials used in this study

1.3 SCoT反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計 體系優(yōu)化試驗(yàn)以‘陜茶一號’茶樹DNA為模板，SCoT25為擴(kuò)增引物，采用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計，對反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和DNA 模板5個影響因素分別設(shè)置4個水平共16 個組合(表2)，重復(fù)3次，總反應(yīng)體系為20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；35個循環(huán)( 94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 在正交試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以直觀分析的最佳水平為標(biāo)準(zhǔn)，分別對20 μL反應(yīng)體系中Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和DNA 模板5個因素進(jìn)行單因素分析試驗(yàn)，濃度水平梯度同正交試驗(yàn)。

1.4 對22份茶樹材料的PCR擴(kuò)增

應(yīng)用優(yōu)化的SCoT-PCR 反應(yīng)體系，選取22條SCoT引物對茶樹材料進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染法顯色并統(tǒng)計條帶。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

每條引物檢測到的每條多態(tài)性帶視為1個等位變異，將電泳圖有帶賦值為“1”，無帶賦值為“0”。利用NTSYS-pc2.10e系統(tǒng)軟件中DICE法計算遺傳相似系數(shù)，用UPGMA進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR體系優(yōu)化

2.1.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 SCoT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示16個組合的條帶數(shù)量和清晰度差異很大(圖1)。其中組合11和12擴(kuò)增的條帶數(shù)最多，且清晰度高。參考韓國輝等[10]的方法對擴(kuò)增的條帶進(jìn)行分析，即根據(jù)電泳條帶的多少及清晰度對16個組合從1～16進(jìn)行打分，結(jié)合評分做直觀分析。直觀分析的極差R值反映該因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的程度，R越大說明該因素對試驗(yàn)結(jié)果影響越大。由表3可知，茶樹SCoT-PCR 反應(yīng)體系中各因素的影響依次為Mg2+>Taq酶>dNTPs>DNA>引物。根據(jù)直觀分析中各因素不同水平的均值(K)大小，表明各因素單一 最 佳 水 平 分 別 為Mg2+2.5 mmol/L，Taq酶0.75 U，dNTPs 0.25 mmol/L，DNA 30 ng，引物0.8 μmol/L。

表2 茶樹SCoT-PCR L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計Table 2 L16(45)orthogonal design for SCoT-PCR system in tea

M.Marker DL 2000 ; 1～16.16個正交試驗(yàn)設(shè)計組合擴(kuò)增結(jié)果 The PCR result of L16(45) orthogonal design products

水平LevelDNA/(ng)Mg2+/(mmol/L)dNTPs/(mmol/L)引物/(μmol/L)PrimerTaq酶/UTaqenzymeK16．754．0010．758．005．50K210．757．2510．507．757．75K39．7512．007．2510．0011．00K46．7510．755．508．259．75R4．008．005．252．255．50

2.1.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果 影響茶樹SCoT-PCR擴(kuò)增最大的因素是 Mg2+，Mg2+濃度太低會降低Taq酶的活性，減少擴(kuò)增條帶，太高則會增加非特異性擴(kuò)增[11]，從圖2中5～8泳道看出，Mg2+濃度為1.5 mmol/L時，條帶非常少，當(dāng)濃度提高到2.5 mmol/L時，擴(kuò)增質(zhì)量最佳。

PCR 反應(yīng)中DNA模板濃度過低可能導(dǎo)致條帶太弱甚至無條帶，過多則會增加非特異性擴(kuò)增。由圖2中1～4泳道看出，4個模板用量都能擴(kuò)增出豐富的譜帶，其中30 ng擴(kuò)增效果最好，與正交試驗(yàn)的結(jié)果相吻合。

dNTPs濃度對PCR反應(yīng)影響較大，由圖2可知，隨著濃度的增加，擴(kuò)增條帶逐漸減少，說明高濃度的dNTPs 不利于擴(kuò)增，故選擇0.25 mmol/L為dNTPs 的最佳濃度。

引物4個水平的濃度均可以擴(kuò)增出清晰的條帶，但是高濃度的引物會提高引物二聚體形成機(jī)率，引起非特異性擴(kuò)增，故選擇濃度低且條帶最清晰的0.7 μmol/L水平為最適濃度。

從圖2看出，隨著TaqDNA 聚合酶用量的增大，條帶亮度提高且更加清晰，0.75 U和1.0 U擴(kuò)增條帶亮度基本一致，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇0.75 U為最佳Taq酶用量。

在正交設(shè)計試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，最終確定茶樹SCoT-PCR總體積為20 μL時，最佳體系為Mg2+2.5 mmol/L，Taq酶0.75 U，引物0.7 μmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，DNA 30 ng。

2.2 22個茶樹材料的SCoT 分析

2.2.1 SCoT 標(biāo)記的等位變異數(shù)和擴(kuò)增片段多態(tài)性 應(yīng)用優(yōu)化的SCoT-PCR體系對‘陜茶1號’及21個陜西本地群體種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測，結(jié)果表明擴(kuò)增條帶多且清晰。統(tǒng)計分析結(jié)果如表4所示，22條引物在22個材料中共檢測出241個等位位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)228個，多態(tài)性比率為94.6%，平均每個引物可擴(kuò)增11個條帶，引物SCoT 18擴(kuò)增出最多的23個條帶(圖3)。SCoT位點(diǎn)的PIC值變化在0.57～0.92間，都為高度多態(tài)基因座。

1～4.DNA模板用量為20 ng、30 ng、40 ng、50 ng 1-4 DNA template 20 ng，30 ng，40 ng，50 ng；5～8.Mg2+濃度為1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L Mg2+concentration 1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L；9～12.dNTPs濃度為0.25、0.3、0.35、0.4 mmol/L dNTPs concentration 0.25，0.3，0.35，0.4 mmol/L；13～16.引物濃度為0.6、0.7、0.8、0.9 μmol/L Primer concentration 0.6、0.7、0.8、0.9 μmol/L；17～20.Taq聚合酶0.25、0.5、0.75、1.0 UTaq0.25、0.5、0.75、1.0 U

圖2 單一因素不同濃度對SCoT-PCR反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of single parameter with different concentrations on SCoT-PCR reaction

M.Marker DL 2000; 1～22.22個材料的PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR results of 22 different materials as templates

2.2.2 供試材料間的遺傳相似系數(shù) 基于22條SCoT引物擴(kuò)增結(jié)果，利用NTSYS-pc 2.10e軟件的DICE法計算遺傳相似系數(shù)。如圖4所示，22個材料間的相似系數(shù)為0.58～0.89，平均相似系數(shù)0.72。其中‘X14-2’和‘X13-1’間的相似系數(shù)最小，‘N13-8’和‘M2’間的相似系數(shù)最大，達(dá)到0.89。

2.2.3 聚類分析 用UPGMA構(gòu)建22個茶樹材料的聚類圖(圖5)。結(jié)果顯示在相似系數(shù)0.67處，‘X14-2’單獨(dú)聚為一組，其余21份材料在相似系數(shù)0.69處分成3類。第1類包括‘Z14-3’‘陜茶1號’和‘N14-3’等3個材料。第2類包括‘Z14-25’‘B11-5’和‘B13-6’等16個材料。第3類包括‘X13-1’和‘X13-11’2個材料。聚類結(jié)果與品種所在茶區(qū)地理分布無明顯規(guī)律。

圖4 供試材料間遺傳相似系數(shù)的頻率分布Fig.4 Distribution of genetic similarity between materials

圖5 22份茶樹材料的SCoT標(biāo)記聚類分析圖Fig.5 Dendrogram of 22 tea materials based on SCoT markers

3 討 論

SCoT 標(biāo)記具有引物通用性廣、能有效產(chǎn)生和性狀連鎖的標(biāo)記、操作簡便、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、方便分子標(biāo)記輔助育種等優(yōu)點(diǎn)，因而在茶樹遺傳研究中有極大的潛力和良好的應(yīng)用前景[12-13]。由于該技術(shù)是基于PCR的標(biāo)記，其結(jié)果易受反應(yīng)體系的影響，在使用前需要對SCoT-PCR體系進(jìn)行優(yōu)化[14]。利用正交試驗(yàn)設(shè)計進(jìn)行PCR優(yōu)化能夠綜合考察各因素交互作用，快速得到理想結(jié)果，減少工作量，被大多數(shù)體系優(yōu)化試驗(yàn)所采用[15-17]。本研究結(jié)合正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)對反應(yīng)體系中的5個因素濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立了茶樹SCoT-PCR體系。與牡丹、薺菜、草莓等材料的已有研究一致，其中，Mg2+濃度對反應(yīng)體系的影響最大，但各因素濃度都略有差異，說明使用SCoT時應(yīng)先優(yōu)化體系，以達(dá)到理想的擴(kuò)增結(jié)果[18-19]。

本研究利用SCoT 標(biāo)記分析了22份來自陜西不同茶區(qū)的茶樹材料，22條引物共檢測出241個等位位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)為228個，多態(tài)性比率為94.6%，其中15條引物的多態(tài)性比率為100%， 22份材料的相似系數(shù)為0.58～0.89，反映出所選材料遺傳多樣性豐富，陜西漢中地區(qū)群體種遺傳背景較寬，是開展茶樹系統(tǒng)選育的資源寶庫。同時也表明，優(yōu)化的SCoT 標(biāo)記能夠有效地應(yīng)用于茶樹遺傳多樣性分析。

親緣關(guān)系分析是開展遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新的基礎(chǔ)。SCoT標(biāo)記具有高多態(tài)性并能夠跟蹤性狀，是直接與性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，能夠用于物種親緣關(guān)系分析，揭示種質(zhì)的遺傳背景。陳虎等[20]利用SCoT標(biāo)記聚類多個龍眼品種，結(jié)果說明SCoT標(biāo)記數(shù)據(jù)在一定程度上反映品種的地理分布情況。趙夢然等[21]對新疆野生白靈菇聚類分析，其結(jié)果也與地理分布大體一致。本研究聚類分析結(jié)果表明，茶樹材料之間并沒有按照地理聚類，這是由于材料所處的幾個茶區(qū)距離上相對較近，茶區(qū)間相互引種，茶樹種質(zhì)交流較頻繁所致。玄參品種的遺傳分析結(jié)果也存在不以地理距離聚類的情況[22]。陜西茶樹種質(zhì)資源的類型劃分目前沿用20世紀(jì)80年代的調(diào)查結(jié)果，根據(jù)群體種茶樹地理分布、葉片大小和葉型分為7大群體28個品種[3]。本研究獲得的聚類結(jié)果說明單純根據(jù)地理分布不能準(zhǔn)確劃分茶樹品種，進(jìn)一步結(jié)合材料葉型特征分析發(fā)現(xiàn)，聚類在一起的材料其葉片大小、葉形亦有一定差別，而來源相同且大小、葉形相似的材料也未聚在一處。其中，聚類結(jié)果與葉片特征有一定相關(guān)性，如都具有葉面平、葉緣微波、葉身稍內(nèi)折特征的‘X14-7’和‘X14-34’2個材料聚在一起；同樣葉面平、葉緣微波的‘X13-22’‘B12-2’‘N13-3’和‘Z14 -21’聚類在一起；而葉面微隆的‘N13-15’與‘B11-8’、‘X13-1’與‘X13-11’、‘X13-10-3’與‘B12-4’兩兩聚在一起。這表明基于SCoT標(biāo)記的聚類可能與茶樹葉片形態(tài)有很大的相關(guān)性。但本研究中由于材料樣本較少，尚未完全涵蓋所有群體品種，利用SCoT標(biāo)記對陜西茶樹群體種分類還需后續(xù)更多試驗(yàn)深入研究。

分子標(biāo)記分析茶樹親緣關(guān)系的新手段可以補(bǔ)充完善傳統(tǒng)的茶樹種群劃分，對研究茶樹現(xiàn)有群體品種有很大的幫助，為開展茶樹系統(tǒng)選種和雜交育種奠定良好的理論基礎(chǔ)。

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