沈建君 張睿 高倩倩 付敏軍 鄭紅斌

浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 浙江 杭州 310053

麥纖散是鄭紅斌教授運用麥芽纖維防治潰瘍性結腸炎（UC）這一訪日留學研究成果，結合臨床經驗配伍而成。本實驗旨在探討在此基礎上酌加白及組成的新麥纖散對UC大鼠結腸黏膜炎癥及血清白介素（IL）-34、IL-35的影響。

1 材料

1.1 動物：60只SD大鼠，雄性，體質量200±20g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，常規(guī)飼料進食，保證環(huán)境清潔、通風。

1.2 藥物：美沙拉嗪緩釋顆粒（上海愛的發(fā)制藥有限公司，批號：H20143164），于研缽中搗碎，加蒸餾水配成一定濃度的混懸液，4℃保存?zhèn)溆?。精選優(yōu)質發(fā)芽大麥，經去糖化、烘干、碾碎、堿-酶結合法提取麥芽纖維。將購于浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)門診部的優(yōu)質茯苓、白及、山藥、馬齒莧、三七制成超細粉末，過120目標準篩，按照一定比例與麥芽纖維充分混勻制成新麥纖散，加蒸餾水配成一定濃度的混懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑：DSS（美國MP公司，貨號：0216011080，分子量36000-50000）；IL-34ELISA測試盒[96T，貨號：CKE95265R，艾萊薩生物科技(上海)有限公司]；IL-35 ELISA測試盒[96T，貨號：CK-E93202R，艾萊薩生物科技(上海)有限公司]；深藍大便隱血檢測試劑盒（安徽深藍醫(yī)療科技股份有限公司，批號：20152400174）。

2 方法

2.1 分組及造模：60只雄性SD大鼠按每組10只，隨機分為正常組，模型組，美沙拉嗪組，新麥纖散低、中、高劑量組。用蒸餾水配成5%DSS溶液予大鼠自由飲用，每日更換，連續(xù)7天，正常組則飲用純凈水。當造模大鼠出現(xiàn)明顯的腹瀉、黏液膿血便等癥狀時，說明UC模型成功復制。

2.2 給藥：UC模型誘導成功后第二天給予相應藥物治療。根據(jù)大鼠與人體每公斤體重劑量折算系數(shù)為6.25，美沙拉嗪緩釋顆粒臨床成人急性發(fā)病期適宜攝入量為4g/d，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪緩釋顆?；鞈乙?.42g/kg每日灌胃；新麥纖散臨床成人急性發(fā)病期適宜攝入量為5g/d，以其3、6、12倍用量，新麥纖散低、中、高劑量組分別給予新麥纖散混懸液1.5、3、6g/kg每日灌胃；其余組大鼠予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)治療2周。

2.3 標本采集：末次給藥24h后，稱量大鼠體重，觀察大鼠糞便性狀，并收集至10ml試管中，按照深藍大便隱血檢測試劑盒說明書進行血便檢測；腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，充分暴露腹主動脈，用10ml的注射器采血，1000r/s離心5min后，小心吸取血清分裝到1.5ml無菌EP管中，-20℃保存?zhèn)溆茫蝗庋塾^察結腸組織，切取病變嚴重部位，置于10%福爾馬林溶液中固定，用于病理切片制作。

2.4 觀察指標與檢測方法：分述如下。

2.4.1 疾病活動指數(shù)（DAI）評分：稱量大鼠體重，肉眼觀察大鼠糞便性狀、血便癥狀，利用公式“疾病活動指數(shù)=(體重評分+糞便性狀評分+隱血評分)/3”給大鼠做DAI評分。0分：體重無下降，大便正常，大便隱血正常；1分：體重下降1%～5%，大便松散，大便隱血陽性；2分：體重下降5%～10%，大便松散，大便隱血陽性；3分：體重下降10%～15%，稀便，肉眼血便；4分：體重下降＞15%，稀便，肉眼血便[1]。

2.4.2 組織病理切片觀察及評分：取大小約為2.0cm×1.0cm×0.3cm的結腸標本，梯度脫水后，石蠟包埋、切片、HE染色后，觀察并評估各組結腸組織的病理變化。評分標準：0分：無上皮損傷和潰瘍形成；1分：糜爛，潰瘍深度和浸潤程度在黏膜下層，輕度水腫和炎性細胞浸潤；2分：潰瘍深度和浸潤程度在肌層，中度水腫和炎性細胞浸潤；3分：潰瘍深度和浸潤程度在漿膜層，重度水腫和炎性細胞浸潤。

2.4.3 ELISA法檢測大鼠血清IL-34、IL-35水平：IL-34、IL-35ELISA測試盒置于室溫20min后，在標準品孔加不同濃度的標準品50μl，樣品孔分別加入待測樣本、樣本稀釋液，然后分別加入抗體、顯色劑A和B后，37℃避光孵育15min，再加入終止液50μl，在450nm波長處測定各孔的OD值，參照標準品線性曲線計算各樣本的表達水平。

2.5 統(tǒng)計學方法：采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，結果用±s表示；各組結果使用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況觀察與DAI評分比較：正常組大鼠飲食照常，體重增加，糞便成形，無明顯不適癥狀。飲用DSS溶液后，多數(shù)老鼠第二天腹瀉嚴重、便溏、體重減輕，三四天后有血便癥狀、精神不振、毛發(fā)光澤差，五六天后情況加重，肛周大片穢物黏附、有明顯膿血便。新麥纖散治療后大鼠血便改善，糞便逐漸成形，體重也有所增加。DAI評分見表1。

3.2 各組結腸組織病理切片觀察及病理損傷評分比較：正常組大鼠結腸黏膜完整，未見潰瘍、水腫，也無炎癥細胞浸潤，模型組大鼠結腸黏膜明顯充血水腫、潰瘍形成，杯狀細胞畸形、減少，腺體排列不規(guī)則，淋巴細胞等炎癥細胞浸潤明顯。新麥纖散低中高劑量組結腸黏膜有不同程度的缺失，少見潰瘍、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，腺體排列較規(guī)則。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理切片（200×）

3.3 各組血清IL-34、IL-35水平變化比較：見表1。

表1 各組大鼠DAI評分、結腸病理損傷評分及血清IL-34、IL-35水平比較（±s）

表1 各組大鼠DAI評分、結腸病理損傷評分及血清IL-34、IL-35水平比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

正常組模型組美沙拉嗪組新麥纖散低劑量組新麥纖散中劑量組新麥纖散高劑量組50.69±5.85 24.33±4.09*40.52±2.88#31.76±2.18#36.27±2.16#34.71±1.51#10 9 10 10 10 10 0.00±0.00 3.51±0.18*0.53±0.32#0.73±0.43#0.57±0.32#0.60±0.31#0.00±0.00 2.33±0.50*0.60±0.21#0.90±0.46#0.65±0.24#0.70±0.26#47.58±7.02 97.04±8.30*59.80±5.56#79.66±4.13#70.63±3.03#71.53±2.29#

4 討論

UC是由多因素導致免疫功能紊亂而介導的慢性炎癥性腸道疾病，病變主要涉及腸道黏膜及黏膜下層，可有淋巴細胞、漿細胞等細胞浸潤，炎癥貫穿于本病始終。中醫(yī)學重視濕熱邪氣在UC發(fā)病中的作用，嗜食肥甘厚膩，脾胃斡旋不利，水谷不化，濕邪內生，郁久化熱，下注腸道、灼傷腸絡，日久引起本病的發(fā)生。新麥纖散正是針對此病因病機配伍而成，散劑中麥芽消食助運；茯苓、山藥化濕和中，健脾固腸；馬齒莧清腸解毒止??；三七、白及止血排膿，化瘀斂瘡。諸藥共奏清腸解毒化濕、健脾厚腸斂瘡之功。

研究表明，IL-34參與并加重UC的炎癥反應[2]，IL-35則與UC的疾病活動度呈負相關[3]。本實驗結果顯示，在DSS誘導的UC大鼠模型中，血清IL-34呈現(xiàn)高表達，而IL-35的表達水平則顯著降低。應用新麥纖散治療后，血清IL-34水平降低，而IL-35水平升高，同時UC大鼠的DAI評分降低，結腸組織損傷減小，潰瘍和炎癥程度減輕，這表明新麥纖散可能通過抑制IL-34的分泌，上調IL-35的表達，起到抗炎愈潰作用，從而有效改善腸道黏膜炎癥，對UC大鼠有較好的療效。

[1]Sánchez-Fidalgo S，Cárdeno A，Sánchez-HidalgoM，et al.Dietary extra virgin olive oil polyphenols supplementation modulates DSS-induced chronic colitis in mice[J].Journal of Nutritional Biochemistry，2013，24(7)：1401-1413.

[2]汪洋，邵建國，卞兆連，等．白細胞介素-34及其在炎癥性腸病中的作用[J].國際消化病雜志，2016，36（5）：264-268.

[3]唐文靜，王婷婷，汪良芝．IL-35在炎癥性腸病中的表達及臨床價值[J].中國醫(yī)藥生物技術，2016，11（2）：142-144.