張智慧 陳芝蕓 葉蕾 嚴(yán)茂祥

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310006

有研究證實，心、腎、肺等組織的局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)與該組織的纖維化密切相關(guān)[1-2]，其主要活性物質(zhì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）主要通過1型受體（AT1）發(fā)揮作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，肝臟組織中也存在著獨立的RAS，而且在肝纖維化時異常激活，肝內(nèi)AngⅡ與纖維化程度呈正相關(guān)[3-4]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，從銀杏科植物銀杏的葉中分離純化的銀杏葉提取物(GbE)具有抗肝細(xì)胞損傷、抑制肝星狀細(xì)胞的激活和轉(zhuǎn)化，降低轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的表達，下調(diào)肝組織中能促進肝細(xì)胞凋亡的P21蛋白表達，減少膠原合成和沉積等作用，有效防止CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的進展[5-6]。本研究旨在探討GbE對四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝臟AngⅡ及其受體表達的影響，進一步闡述GbE抗肝纖維化的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠48只，體重190-210g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心SPF屏障系統(tǒng)中。

1.2 主要藥物與試劑：GbE由西安中鑫生物技術(shù)有限公司提供，含24.03%的黃酮苷和6.15%的銀杏內(nèi)酯。CCl4為上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。羥脯氨酸(Hyp)測試盒南京建成生物工程研究所；AngⅡ放免試劑盒為解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所產(chǎn)品；血管緊張素酶(ACE)ELISA試劑盒為美國ADL公司產(chǎn)品；Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Perfect Real Time-SYBR Premix EX TaqTM試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成：AngⅡ上游引物：5'-AGC ACG GAC AGC ACC CTA TT-3'，下游引物：5'-AGA ACT CAT GGA GCC CAG TCA-3'，擴增片段：91bp；AT1上游引物：5'-TAT CAC AGT GTG CGC GTT TCA-3'，下游引物：5'-TGG TAA GGC CCA GCC CTA T-3'，擴增片段：68bp；β-actin上游引物：5’-TGT TGC CCT AGA CTT CTT CGA GCA-3’，下游引物：5’-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3’；擴增片段：112bp；BCA試劑盒、鼠抗α-Tubulin為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，鼠抗AT1單克隆抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG、化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒均為聯(lián)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器：SN-695智能放射免疫γ測量儀為上海原子核研究所日環(huán)儀器廠產(chǎn)品，VITEK比色計為美國HACH公司產(chǎn)品，ABI 7500熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品，BIO-RAD圖像分析、SD Semi-Dry型半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、MiniP3型垂直電泳槽均為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.4 分組及處理：40只大鼠隨機分成正常組、模型組、GbE高劑量組、GbE中劑量組、GbE低劑量組共5組，每組8只；模型組及各藥物干預(yù)組以40%的CCl4（CCl4：橄欖油=2∶3）皮下注射，3ml·Kg-1·d-1，每周2次，首次加倍，連續(xù)6周，正常組每周2次以等容量橄欖油皮下注射，同時GbE高、中劑量組、低劑量組每天以200、100、50mg·Kg-1·d-1的GbE灌胃；正常組和模型組每天灌服等容量的蒸餾水，均干預(yù)6周；末次給藥當(dāng)晚各大鼠禁食不禁水，次日空腹麻醉下取血和肝組織，部分肝組織中性甲醛固定，另外存-80℃冰箱待用。

1.5 檢測方法：肝臟中Hyp含量采用堿水解法檢測。肝組織病理采用常規(guī)石蠟包埋，Masson膠原染色，光鏡觀察，肝纖維化程度分級標(biāo)準(zhǔn)[7]：0級為無肝纖維化；1級為輕度，纖維沉積僅位于小葉中央；2級為中度，纖維沉積擴展至小葉中央之外，但未至小葉邊緣；3級為重度，纖維沉積擴展至小葉邊緣；4級為早期肝硬化（定性標(biāo)準(zhǔn)）。血漿AngⅡ水平采用放免法檢測，血漿ACE水平采用ELISA法檢測。以Trizol抽提肝組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，采用Realtime-PCR法檢測AngⅡ及其受體AT1mRNA表達，β-actin為內(nèi)參，相對表達量(2-△△Ct)來表示目的基因AngⅡ和AT1mRNA的表達水平。以RIPA組織裂解液對肝組織勻漿提取總蛋白，Western blot法檢測AT1蛋白表達，X線膠片曝光顯影，BIO-RAD圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描，以α-Tubulin為內(nèi)參，相對表達量表示AT1蛋白表達的水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析方法：采用SPSS11.5軟件統(tǒng)計，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，正態(tài)分布資料采用單因素方差分析，非正態(tài)分布資料轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布后再進行單因素方差分析；等級資料采用非參考秩和檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 GbE對肝纖維化大鼠肝組織纖維化程度的影響：模型組大鼠肝組織Hyp水平較正常組均明顯增高（P＜0.01），GbE高、中、低劑量組Hyp水平較模型組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 GbE對大鼠肝組織Hyp水平的影響(±s)

表1 GbE對大鼠肝組織Hyp水平的影響(±s)

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01。

肝組織Hyp(ug/mg濕重)217.75±48.8 410.25±91.83**304.37±32.14**ΔΔ 335.37±32.14**Δ 344.50±40.10**Δ分組正常組模型組GbE高劑量組GbE中劑量組GbE低劑量組只數(shù)88888

2.2 GbE對肝纖維化大鼠肝組織纖維化程度的影響：

Masson膠原染色顯示，正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)較完整，僅少量血管壁有藍色膠原著色；模型組大鼠肝組織有大量著藍色膠原纖維沉積，纖維間隔較寬，伴大量的脂肪空泡。GbE各劑量組藍色膠原纖維沉積較模型組大鼠減少，纖維間隔也較較模型組大鼠變窄，且脂肪空泡減少（P＜0.05，P＜0.01）。經(jīng)過統(tǒng)計，各組大鼠肝纖維化分級情況見表2。

表2 GbE對大鼠肝組織纖維化程度的影響(例)

2.3 GbE對大鼠血漿AngⅡ、ACE水平的影響：模型組大鼠血漿AngⅡ、ACE水平較正常組均明顯增高（P＜0.01），GbE高、中、低劑量組大鼠血漿AngⅡ、ACE水平較模型組不同程度明顯降低（P＜0.05；P＜0.01），見表3。

表3 GbE對大鼠肝組織Hyp及血漿AngⅡ、ACE水平的影響(±s)

表3 GbE對大鼠肝組織Hyp及血漿AngⅡ、ACE水平的影響(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01。

25.88±4.50 39.08±4.74**30.16±6.95ΔΔ 32.23±6.19*Δ 33.26±3.99**Δ正常組模型組GbE高劑量組GbE中劑量組GbE低劑量組88888 65.02±28.06 152.16±40.51**81.89±26.31ΔΔ 83.27±26.47ΔΔ 94.06±21.23ΔΔ

2.4 GbE對大鼠肝組織AngⅡ及其受體表達的影響：模型組大鼠肝組織AngⅡmRNA、AT1mRNA及蛋白表達水平顯著高于正常組(P＜0.01)；GbE高、中、低劑量組大鼠肝組織AngⅡmRNA、AT1mRNA及蛋白表達水平均明顯低于模型組(P＜0.05，P＜0.01)。見圖1、圖2。

3 討論

近年研究表明，在心血管組織以外的消化道、肝、肺、皮膚等的局部組織和器官中也獨立存在著RAS，局部組織的RAS也可合成AngⅡ[8-9]。AngⅡ除調(diào)節(jié)血液動力學(xué)作用外，還作為一種促纖維化因子和生長因子影響細(xì)胞的增殖和分裂[10]。AngⅡ是通過與組織細(xì)胞上特異性的受體結(jié)合，發(fā)揮促細(xì)胞增殖和ECM合成的作用的[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化患者中AngⅡ的升高與纖維化程度有關(guān)，肝纖維化形成過中血漿及肝組織中AngⅡ水平與纖維化程度呈明顯正相關(guān)，AT1基因表達量也隨著纖維化程度的增加而增強多，ACE活性在纖維化肝組織中也顯著升高[12-13]。

圖1 各組大鼠肝臟AngⅡmNRA、AT1mRNA表達（n=8）

圖2 各組大鼠肝臟AT1蛋白表達（n=8）

Hyp是膠原蛋白所特有的氨基酸，測定肝組織中Hyp的量可衡量膠原總體水平，間接反映肝纖維化的程度，是肝纖維化檢測的重要指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化模型組大鼠肝組織Hyp水平較正常組顯著增高（P＜0.01），表明模型大鼠肝組織膠原沉積增多；病理組織學(xué)Masson染色也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝組織纖維膠原沉積明顯增多（P＜0.01）。研究同時發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血漿AngⅡ、ACE水平較正常組顯著升高（P＜0.01），肝組織AngⅡmRNA、AT1RmRNA和蛋白的表達均較正常組明顯升高（P＜0.01）；提示AngⅡ和AT1R可能參與CCl4肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。以不同劑量的GbE干預(yù)6周后，大鼠肝組織Hyp水平較模型組明顯減少（P＜0.05，P＜0.01），血漿AngⅡ、ACE水平較模型組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），肝組織AngⅡmRNA、AT1mRNA和蛋白的表達均較模型組明顯降低。綜合實驗得出的結(jié)論，結(jié)合前期研究GbE能抑制肝星狀細(xì)胞的激活和轉(zhuǎn)化，降低肝組織TGF-?1表達[5]，提示GbE可以抑制RAS系統(tǒng)的反應(yīng)，可能通過降低肝組織AngⅡ水平，引起AngⅡ受體AT1的密度減低，抑制肝內(nèi)AngⅡ與AT1R相結(jié)合，顯著降低TGF-?1等的表達和分泌，抑制TGF-β1的致纖維化效應(yīng)達到抗肝纖維化作用。研究結(jié)論為揭示銀杏葉提取物抗肝纖維化的作用機制提供了實驗基礎(chǔ)。

[1]Jiang JS,Lang YD,Chou HC et,al.,ctivation of the renin -angiotensin system in hyperoxia-induced lung fibrosis in neonatal rats[J].Neonatology,2012,101(1)：47-54.

[2]Navar LG.Intrarenal renin-angiotensin system in regulation of glomerular function[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2014,23(1)：38-45.

[3]Munshi MK,Uddin MN,Glaser SS.The role of the renin-angiotens insysteminliver fibrosis[J].Exp Biol Med(Maywood),2011,236(5)：557-566.

[4]Goh GB,Pagadala MR,Dasarathy J，et al.Renin-angiotensin system and fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease[J].Liver Int,2015,35(3)：979-985.

[5]姚嘉明,陳芝蕓,嚴(yán)茂祥,等.銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠TGF-β1表達的影響[J].中國中醫(yī)藥科技,2008,15(3)：186-188.

[6]何蓓暉,陳瑜,陳芝蕓,等.銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠肝組織P21表達的影響[J].浙江中醫(yī)雜志，2011,46（11）：840-841.

[7]Oh WY,Pyo S,Lee KR,et al.Effect of Hootrichia diomphalia larvae on liver fibrosis and hepatotoxicity in rats[J].J Ethnopharamacol,2003,87(2-3)：175-180.

[8]Oka T,Komuro I.Molecular and cellular mechanisms of organ fibrosis[J].Nihon Rinsho.2012，70(9)：1510-1516.

[9]Speca S,Giusti I,Rieder F,et al.Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis[J].World J Gastroenterol,2012，18(28)：3635-3661.

[10]Li A,Zhang J,Zhang X,et al.Angiotens in Ⅱ induces connective tissue growth factor expression in tuman hepatic stellate cells by a transforming growth factor β-in dependent mechanism[J].SciRep,2017,7(1)：7841.

[11]Llorens-Cortes C,Greenberg B,Huang H,et al.Tissular expression and regulation of type 1 angiotensinⅡsubtypes by quantitative reverse trans criptase- polymerase chain reaction analysis[J].Hypertension,1994,24：538-548.

[12]Abbas G,Silveira MG,Lindor KD.Hepatic fibrosis and the renin-angiotensin system[J].Am J Ther,2011,18(6)：202-208.

[13]Zhang W,Miao J,Li P,et al.Up-regulation of components of the renin-angiotensin system in liver fibrosis in the rat induced by CCl4[J].Res Vet Sci,2013,95(1)：54-58.