高雪梅，張志

（吉林農(nóng)業(yè)科技學院制藥工程學院，吉林吉林132101）

恩諾沙星（Enrofloxacin），又名恩氟奎林羧酸，屬于第三代奎諾酮類之化學合成抑菌劑，是動物專用抗菌藥物，對革蘭氏陰性桿菌、格蘭仕陽性菌和葡糖糖非醇都具有很強的活性，殺菌活性強、體內(nèi)分布廣泛，與其他抗菌藥物無交叉耐藥性，已經(jīng)廣泛用于國內(nèi)外的獸醫(yī)臨床[1,2]。臨床上主要用于動物大腸桿菌、分支桿菌和禽大腸桿菌的感染。但其會出現(xiàn)胃腸道反應、過敏反應、心血管反應、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、肝腎功能異常、支氣管哮喘、低血糖等不良反應和毒副作用，并且長期用藥產(chǎn)生的耐藥性問題也日趨嚴重[3]，其原因與喹諾酮類藥物在動物方面的使用量增加有關。為了監(jiān)控喹諾酮類藥物在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的應用，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布了第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》，在2002年對恩諾沙星在雞組織中的殘留標志物（恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星之和），殘留限量為：100～300 μg/kg，肌肉0.1mg/kg，肝臟0.2 mg/kg，腎臟0.3 mg/kg[4]。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第278號公告對各種動物使用恩諾沙星的休藥期都作了規(guī)定，其中恩諾沙星用于雞的休藥期為8d[5]。希望通過本研究能夠找到恩諾沙星微球在動物體內(nèi)的代謝規(guī)律，為實現(xiàn)恩諾沙星新劑型的開發(fā)提供臨床使用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑與藥品

恩諾沙星淀粉微球，批號20160803，自制。恩諾沙星對照品，含量99.16%；環(huán)丙沙星對照品，含量84.2%，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗動物

35只黃羽肉雞，40日齡，體重為（1.5±0.2）kg，公母各半，由吉林農(nóng)業(yè)科技學院養(yǎng)殖場提供。

1.3 給藥與采樣

適應期過后，分別臨床推薦劑量的高限（以恩諾殺星計，1L飲水，雞100mg）飲水給藥，連續(xù)飲水7d后停藥。在停藥后4h（即零休藥期）、1d、3d、5d、7d、9d、11d共7個時間點，每個時間點宰殺5只雞進行采樣。雞經(jīng)頸靜脈放血處死，取出100～200g肌肉/每只雞，取全肝，取全腎。采集后的所有組織樣品不進行任何處理，立即放入包裝袋并做好標記，放入冰箱-20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定方法

1.4.1 樣品的預處理

稱取一定量的采集樣品，置30 mL勻漿杯中，加定量磷酸鹽緩沖液，10000 r/min勻漿1 min，勻漿液轉入50 mL聚丙烯帶蓋離心管中，振蕩混合5 min，4000 r/min離心10 min，然后將上清液置于25 mL離心管中。用定量磷酸鹽緩沖液清洗勻漿機內(nèi)部，將剩余的殘渣都放入50 mL離心管，攪拌均勻，并且離心分離，最后合并所有上清液倒入25 mL離心管中備用。C18固相萃取柱按次序用2 mL甲醇，2 mL水潤洗，洗完之后精密量取5 mL備用液過柱，然后用2 mL的水淋洗擠干。再加入流動相1.0 mL洗脫擠干，最后洗脫液全部收集。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾得待測溶液。

1.4.2 高效液相色譜條件

色譜柱：C18（150mm×4.6 mm，5μm）；粒徑5μm；流動相：0.05 mol/L磷酸/三乙胺-乙腈（82-18），用前過0.45μm濾膜；流速0.8mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長450nm；進樣量：20μL。

在選定的高效液相色譜條件下，恩諾沙星、環(huán)丙沙星均可以與其他組分分開，恩諾沙星保留時間在8.5min左右，環(huán)丙沙星保留時間在7min左右。該法檢測限為20μg/kg，恩諾沙星與環(huán)丙沙星進行回收率試驗，其回收率都在70%以上，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別小于8%和10%。標準曲線在0.01μg/mL～1μg/mL濃度范圍內(nèi)，恩諾沙星的線性回歸方程為:y=4871.4x-0.8632，相關系數(shù)r=0.9996；環(huán)丙沙星為:y=2786.5x+1.4865，相關系數(shù)r=0.9998，線性關系良好。

2 結果與分析

2.1 各組織樣品檢測的色譜圖

雞空白肝臟色譜圖見圖1；恩諾沙星和環(huán)丙沙星休藥4h后肝臟色譜見圖2。

2.2 雞各組織中恩諾沙星與環(huán)丙沙星殘留測定結果

分別在0d、1d、3d、5d、7d、9d、11d進行采集雞組織，按上面“樣品預處理”方法進行處理后，通過HPLC測定環(huán)丙沙星（CIP）和恩諾沙星（ENR）的殘留量結果，通過公式計算得到恩諾沙星淀粉微球飲水停藥后，不同休藥時間雞各組織中ENR和CIP的殘留量總和（見表1）。

由表1可知，恩諾沙星淀粉微球在零休藥期時，肌肉、肝臟和腎臟中恩諾沙星殘留物的平均殘留量分別為3.5674mg/kg、5.9202mg/kg和1.3828 mg/kg。在停藥5d后，在雞的肌肉組織和肝臟組織中的總殘留含量仍然高于最高殘留量（MRL），腎臟組織的總殘留量在停藥第3d已經(jīng)降到0.0395 mg/kg，低于《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中的MRL。停藥7d后，肌肉和肝臟的總殘留量降至相應的MRL以下，第9d以后均為檢測出殘留量。恩諾沙星及主要代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在肝臟中殘留量較高，且消除相對緩慢，藥物在腎臟中的殘留量均低于同期的肝臟。而在肌肉組織中代謝消除較快，殘留量下降迅速。

圖2 肝臟休藥后4h色譜圖

表1 恩諾沙星淀粉微球飲水停藥后不同休藥時間ENR和CIP殘留量（mg/kg）

3 討論

恩諾沙星淀粉微球飲水給藥，在臨床上給藥的方案是連續(xù)用藥5d，本實驗采取連續(xù)飲水用藥7d的方案，是以用藥的最大量降低因實際使用藥物的過程中，出現(xiàn)的殘留危害。以ENR以及ENR的主要代謝物CIP殘留總量為標示殘留物，通過測定雞內(nèi)標示殘留物的量，結果指出，恩諾沙星淀粉微球按推薦劑量的最大限量用藥，該藥物劑型在雞各組織中的總殘留量在用藥7d低于國家最高殘留限量。從雞的肌肉組織、肝臟組織和腎臟組織中的總殘留量的消除情況來看，本實驗建議恩諾沙星淀粉微球這種劑型的休藥期為7d。

[1] 中國獸藥典委員會編.獸藥使用指南[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[2] D.J.Dimitrova,L.D.Lashev,S.G.Yanev,B.Pandova.Pharmacokinetics of enrofloxacin in turkeys[J].Research in Veterinary Science,2007(82):392-397

[3] 杜鋒.恩諾沙星、環(huán)丙沙星在雞組織中殘留量的檢測方法研究[J].中國獸藥雜志，1999(04):5-8.

[4] 毛浩玉.喹諾酮類抗菌藥不良反應及其機制研究現(xiàn)狀[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊,2004,25(01)：23-26.

[5] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號.動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].2002.

[6] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第278號.獸藥停藥期規(guī)定[S].2003.