郭俊花，許先猛，馬 欣，王曉東，李賑群

(運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院有機(jī)食品工程系，山西運(yùn)城 044000)

微生物酵素是指以1種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、中草藥等為原料，經(jīng)多種有益菌發(fā)酵而產(chǎn)生，含有豐富微生物、酶、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品[1]。酵素菌是一種微生物，又被稱為農(nóng)用酵素(BYM)，早在20世紀(jì)40年代由日本的島本覺發(fā)明，并在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用[2]，而酵素菌肥可以改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤供肥能力，又可以抑制有害病菌，促進(jìn)作物早熟，改善果樹樹體營養(yǎng)，提高水果的產(chǎn)量和質(zhì)量[3]。目前，對果蔬酵素的研究主要是優(yōu)化發(fā)酵工藝、功能性成分研究等方面[4-7]，且主要強(qiáng)調(diào)酵素在食用、保健方面的突出功效，果蔬酵素對種植業(yè)的功效研究較少。

蘋果是我國的第一大水果，2016年產(chǎn)量達(dá)5 400萬t，占世界總產(chǎn)量的50%以上，其中約有20%用于工業(yè)化深加工，每年將產(chǎn)生數(shù)以萬噸的蘋果渣，而這些蘋果渣除少量用作燃料、飼料和提取果膠外，大部分被當(dāng)做垃圾處理，造成資源極大浪費(fèi)[8]。本試驗(yàn)以蘋果果脯加工企業(yè)生產(chǎn)過程中的下腳料——蘋果皮渣為原料，利用果皮本身含有的天然有益微生物進(jìn)行蘋果皮渣酵素制備，并將蘋果皮渣酵素運(yùn)用在有機(jī)蘋果的種植過程中，研究酵素對蘋果生長過程果實(shí)品質(zhì)的影響，以提高蘋果皮渣的利用價(jià)值，減少巨大的資源浪費(fèi)，并能為蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展另辟蹊徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 蘋果皮渣，由山西澤源食品有限公司提供。

1.1.2 試劑 純度98%的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，由貴州遵義佳宏化工有限公司生產(chǎn)；福林酚試劑、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，為美國Sigma公司產(chǎn)品；抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品，由上海谷研生物化學(xué)研究所生產(chǎn)；氫氧化鈉、無水碳酸鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、草酸、2，6-二氯靛酚、碳酸氫鈉、亞鐵氰化鉀、亞甲基藍(lán)、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，均為分析純，市購。

1.1.3 儀器 JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)，江蘇常州國華電器有限公司生產(chǎn)；JY92-Ⅱ超聲細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)；1/1 000 g BSA323S電子分析天平，德國賽多利斯公司生產(chǎn)；3K15高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司生產(chǎn)；FE20K pH計(jì)，瑞士梅特勒托利多公司生產(chǎn)；WYT-32ATC手持糖度折光儀，福建泉州儀器有限公司生產(chǎn)；游標(biāo)卡尺0～150 mm，上海量具刃具廠生產(chǎn)；GY-B硬度計(jì)，吉林四平機(jī)械設(shè)備公司生產(chǎn)；SX2-4-10馬福爐，北京科偉儀器有限公司生產(chǎn)；754紫外分光光度計(jì)、722N可見分光光度計(jì)，上海菁華儀器有限公司生產(chǎn)；1 000 W萬用電爐，天津泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果皮渣酵素發(fā)酵工藝 將蘋果皮渣打漿，用超聲波400 W處理10 min；紅糖用紫外線殺菌45 min，用無菌水溶解，置于已滅菌的玻璃瓶中，加入蘋果皮渣，攪拌均勻，用蘋果醋調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至合適值；封口，放于暗處，15～25 ℃下發(fā)酵[9]。

1.2.2 蘋果皮渣酵素發(fā)酵的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 蘋果皮渣量 分別取100、200、300、400、500 g蘋果皮渣，打漿，超聲波處理；分別取90 g紅糖溶解于1 000 mL無菌水中，置于已滅菌的玻璃瓶中，并加入蘋果皮渣，攪拌均勻，用蘋果醋調(diào)節(jié)初始pH值至5.0；封口，放于暗處，15～25 ℃下發(fā)酵150 d；測定蘋果皮渣酵素的酵素超氧化物歧化酶(SOD)活性和總酸含量。

1.2.2.2 加糖量 取300 g蘋果皮渣，打漿，超聲波處理；分別取30、60、90、120、150 g紅糖溶解于1 000 mL無菌水中，置于已滅菌的玻璃瓶中，加入蘋果皮渣，攪拌均勻，用蘋果醋調(diào)節(jié)初始pH值至5.0；封口，放于暗處，15～25 ℃下發(fā)酵150 d；測定蘋果皮渣酵素的SOD活性和總酸含量。

1.2.2.3 初始pH值 取300 g蘋果皮渣，打漿，超聲波處理；分別取90 g紅糖溶解于1 000 mL無菌水中，置于已滅菌的玻璃瓶中，加入蘋果皮渣，攪拌均勻，分別用蘋果醋調(diào)節(jié)初始pH值至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；封口，放于暗處，15～25 ℃下發(fā)酵150 d；測定蘋果皮渣酵素的SOD活性和總酸含量。

1.2.2.4 發(fā)酵時(shí)間 取300 g蘋果皮渣，打漿，超聲波處理；分別取90 g紅糖溶解于1 000 mL無菌水中，置于已滅菌的玻璃瓶中，加入蘋果皮渣，攪拌均勻，分別用蘋果醋調(diào)節(jié)初始pH值至5.0；封口，放于暗處，15～25 ℃下分別發(fā)酵90、120、150、180、210 d；測定蘋果皮渣酵素的SOD活性和總酸含量。

1.2.3 蘋果皮渣酵素發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蘋果皮渣添加量、紅糖添加量、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間為自變量因素，以SOD活性和總酸含量為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以確定蘋果皮渣酵素的最佳發(fā)酵工藝條件(表1)。

表1 蘋果皮渣酵素發(fā)酵正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.4 蘋果皮渣酵素對紅富士蘋果生長過程中果實(shí)品質(zhì)的影響 以山西省運(yùn)城市臨猗縣孫吉有機(jī)果園為試驗(yàn)點(diǎn)，選擇樹勢均勻一致、果園土壤差異相對較小、栽培措施基本一致的10年生紅富士蘋果樹為試驗(yàn)對象，選擇10株于當(dāng)年9月26日，次年3月28日、5月2日分別施入5、2、2 kg/株蘋果渣酵素，另選10株不施蘋果渣酵素作為對照。果樹生長期間不進(jìn)行其他施肥管理。蘋果生長過程中，測定2個(gè)處理的總酸、可溶性固形物含量及固酸比、硬度，6月15日進(jìn)行第1次采樣，后每隔14 d采樣1次，直至果實(shí)成熟，其中蘋果成熟期還另測定果實(shí)的單果質(zhì)量、果形指數(shù)、總灰分、維生素C含量、蛋白質(zhì)含量、還原糖含量、水解后還原糖含量、多酚含量及黃酮含量。每次隨機(jī)抽取10個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。

1.2.5 測定方法 分別采用鄰苯三酚自氧化法、福林酚法、硝酸鋁絡(luò)合分光光度法測定SOD活性、多酚含量、黃酮含量[10-13]；分別采用手持糖度折光儀、GY-B硬度計(jì)、游標(biāo)卡尺、精度為千分之一的電子天平測定果實(shí)可溶性固形物含量、硬度、果實(shí)縱徑和橫徑、單果質(zhì)量；分別參照標(biāo)準(zhǔn)《食品中總酸的測定》(GB/T 12456—2008)、《食品中灰分的測定》(GB 5009.4—2016)、《食品中抗壞血酸的測定》(GB 5009.86—2016)、《食品中蛋白質(zhì)的測定》(GB 5009.5—2010)、《食品中還原糖的測定》(GB 5009.7—2016)、《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》(GB 5009.8—2008)測定總酸(可滴定酸)含量、總灰分、維生素C含量、蛋白質(zhì)含量、還原糖含量及水解后還原糖含量。固酸比為可溶性固形物含量與總酸含量的比值，果形指數(shù)為果實(shí)縱徑和橫徑之比。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果皮渣酵素發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.1.1 蘋果皮渣添加量的確定 蘋果皮表面含有大量的天然微生物菌群，可為酵素發(fā)酵提供酵母菌、醋酸菌等必需的微生物。由圖1可見，隨著蘋果皮渣添加量的增加，發(fā)酵液中有益微生物數(shù)量增加，從而使發(fā)酵液中SOD活性和總酸含量均呈上升趨勢；當(dāng)蘋果皮渣添加量為100～300 g/L時(shí)，SOD活性和總酸含量增加相對較快，繼續(xù)增加蘋果皮渣量，SOD活性和總酸含量上升趨勢緩慢，故選擇最佳蘋果皮渣添加量為300 g/L。

2.1.2 紅糖添加量的確定 紅糖可為發(fā)酵液中的有益菌群提供充足的碳源，使有益生物菌群大量繁殖，并產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，考察紅糖添加量可為微生物的生長代謝確定合適的碳源量。由圖2可見，當(dāng)紅糖添加量為90 g/L時(shí)，SOD活性達(dá)到最大值，此時(shí)總酸含量為3.9 g/L，且隨紅糖添加量的增加，總酸含量變化不大。故選擇最佳加糖量為90 g/L。

2.1.3 初始pH值的確定 將蘋果醋加入到發(fā)酵液中，既可以調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使其呈弱酸性，有效抑制有害菌群的繁殖，又可以抑制乙醇的產(chǎn)生，有利于耐酸性酶的產(chǎn)生與活性保持，為有益菌群的大量繁殖提供條件[9]。由圖3可見，初始pH值對酵素的總酸含量和SOD活性有較大影響，初始pH值調(diào)至5.0時(shí)，二者達(dá)到最大值。故確定最佳初始pH值為 5.0。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的確定 由圖4可見，發(fā)酵前120 d內(nèi)，由于微生物的大量繁殖代謝，總酸含量和SOD活性有明顯上升，發(fā)酵150 d時(shí)總酸含量和SOD活性達(dá)到最大值，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，微生物代謝活動(dòng)逐漸減弱，總酸含量和SOD活性略有下降。因此，選擇最適發(fā)酵時(shí)間為150 d。

2.2 蘋果皮渣酵素發(fā)酵正交試驗(yàn)

由表2可見，影響蘋果皮渣酵素總酸含量的因素主次順序?yàn)锽>A>D>C，即加糖量對總酸含量有很大影響，是主要控制因素，其次是蘋果添加量，最優(yōu)發(fā)酵組合為B2A3D2C3；影響蘋果皮渣酵素中SOD活性的因素主次順序?yàn)锽>A>C>D，最優(yōu)組合也為B2A3D2C3。因此，確定最佳發(fā)酵工藝為蘋果皮渣添加量400 g/L、加糖量90 g/L、初始pH值5.5、發(fā)酵時(shí)間150 d。經(jīng)測定，在優(yōu)化條件下酵素總酸含量為 3.96 g/L，SOD活性為66.2 U/mL。

2.3 蘋果皮渣酵素對富士蘋果品質(zhì)的影響

2.3.1 蘋果皮渣酵素對富士蘋果生長過程中果實(shí)品質(zhì)的影響

2.3.1.1 可溶性固形物 可溶性固形物含量是果實(shí)重要的品質(zhì)性狀之一，其含量高低對果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味口感、實(shí)質(zhì)產(chǎn)量等方面有重要影響，并對果實(shí)儲藏、運(yùn)輸過程中的防凍等有重要影響[14]。由圖5可知，在生長期間，施入酵素和未施酵素(對照)蘋果果實(shí)的可溶性固形物含量呈明顯上升趨勢；對照處理的蘋果可溶性固形物含量低于酵素處理；生長前期，2個(gè)處理的可溶性固形物含量相差較小，8月10日后2個(gè)處理的果實(shí)可溶性固形物含量差距增加，蘋果皮渣酵素的施用明顯提高了蘋果生長后期的可溶性固形物含量，從而明顯改善了蘋果的風(fēng)味及品質(zhì)。果實(shí)中的酸含量也是影響果實(shí)品質(zhì)的重要因素[14]。

2.3.1.2 總酸含量 由圖6可見，在生長期間，施入酵素的蘋果總酸含量變化趨勢與未施入酵素相似，呈逐漸下降趨勢，同一時(shí)期施入酵素的蘋果總酸含量高于對照，說明施入酵素可促進(jìn)蘋果果實(shí)中有機(jī)酸的積累；6月15日至7月13日，2個(gè)處理的總酸含量緩慢下降，7月27日后總酸含量下降迅速。

表2 蘋果皮渣酵素發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

注：k1、k2、k3、R為總酸對應(yīng)數(shù)值；k1′、k2′、k3′、R′為SOD活性對應(yīng)數(shù)值。

2.3.1.3 糖酸比 蘋果的風(fēng)味品質(zhì)主要取決于糖酸含量及其配比關(guān)系，高糖低酸的果實(shí)口感淡薄，低糖高酸的果實(shí)口感過酸，都不符合鮮食要求[15]。由圖7可見，施入酵素的蘋果與對照蘋果相比，固酸比差異不大，僅在8月10日至9月21日之間施入酵素的蘋果固酸比稍大，至成熟時(shí)二者固酸比又幾乎相同。

2.3.1.4 果實(shí)硬度 由圖8可見，施入酵素和未施入酵素(對照)的蘋果硬度均呈先上升后降低趨勢，8月10日二者的硬度達(dá)到最大值；生長期間，對照蘋果的硬度均低于酵素處理的蘋果，說明施用酵素可提高蘋果果實(shí)的硬度，從而進(jìn)一步延長蘋果的貨架期。

2.3.2 蘋果皮渣酵素對富士蘋果成熟果實(shí)品質(zhì)的影響 由表3可見，施入酵素的蘋果果形指數(shù)低于對照處理，相互間差異不顯著(P>0.05)；除果形指數(shù)外，施入酵素的蘋果其他指標(biāo)均大于對照，其中總灰分、維生素C含量、水解后還原糖含量、果皮中多酚含量、果肉中黃酮含量與對照相比差異不顯著(P>0.05)，單果質(zhì)量、去皮硬度、總酸含量、蛋白質(zhì)含量、果肉中多酚含量、果皮中黃酮含量與對照相比差異顯著(P<0.05)，可溶性固形物、還原糖含量與對照相比差異極顯著(P<0.01)。

表3 施入酵素對紅富士蘋果果實(shí)品質(zhì)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)注“*”“**”分別表示處理間差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以果脯制作過程中廢棄的蘋果皮渣為原料，利用蘋果本身含有的天然有益微生物制備蘋果皮渣酵素，通過單因素和正交試驗(yàn)表明，蘋果皮渣酵素的最佳發(fā)酵條件為蘋果渣添加量400 g/L、加糖量90 g/L、初始pH值5.5、發(fā)酵時(shí)間150 d，此優(yōu)化條件下酵素的總酸含量為3.96 g/L，SOD活性為66.2 U/mL。

有研究表明，總酸含量為2～5 g/kg、含糖量較高(可溶性固形物含量≥14.5%或總糖含量≥12.5%)、固酸比偏低(3.0～3.5)時(shí)的果實(shí)酸甜適宜，風(fēng)味品質(zhì)相對較好，優(yōu)質(zhì)率最高[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，施入酵素成熟期的蘋果總酸含量為5.7 g/kg、可溶性固形物含量為14.72%、固酸比為2.58，說明施用蘋果皮渣酵素可以一定程度上提高紅富士蘋果的風(fēng)味與品質(zhì)，提高了蘋果的優(yōu)質(zhì)率。

將制得的蘋果皮渣酵素施用于有機(jī)紅富士蘋果園，考察施入蘋果皮渣酵素對紅富士蘋果果實(shí)品質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)，施入酵素的蘋果在生長過程中可溶性固形物含量、總酸含量、硬度均高于未施入酵素的蘋果(對照)，固酸比差別大不；蘋果成熟期時(shí)，除果形指數(shù)外，單果質(zhì)量、硬度、可溶性固形物含量、總酸含量、總灰分、維生素C含量、蛋白質(zhì)含量、還原糖含量、水解后還原糖含量、多酚含量、黃酮含量等指標(biāo)均高于對照，這可能是因?yàn)槔脧U棄蘋果皮渣制備而成的酵素，一方面其含有的有機(jī)酸可以調(diào)節(jié)土壤pH值，豐富的有機(jī)物可以提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，進(jìn)而提高土壤中各種微量元素的有效含量，另一方面，各種有益微生物及發(fā)酵后產(chǎn)生的各種酶能夠迅速催化分解各種有機(jī)物，使之在短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化為可供利用的成分，被果實(shí)吸收利用[3，16-18]，進(jìn)一步促進(jìn)蘋果中各種營養(yǎng)和功能成分的積累，果實(shí)品質(zhì)得到提升，也使廢棄資源得到有效利用。在今后的研究中，還應(yīng)對酵素對土壤養(yǎng)分含量的影響及有害病菌的抑制等方面進(jìn)行深入探索，以更全面地了解酵素在蘋果種植過程中的應(yīng)用效果。

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