許先猛，董文賓，盧 軍，景建國

(1.運城職業(yè)技術(shù)學(xué)院有機食品工程系，山西運城 044000；2.陜西省漢中市食品藥品檢驗所，陜西漢中 723000；3.山西澤源食品有限公司，山西運城 044000)

中國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)地，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的40%以上[1]。蘋果中含有豐富的膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)、蘋果酸、糖、蛋白質(zhì)和多酚類物質(zhì)[2]，因此，蘋果及其深加工產(chǎn)品廣受消費者歡迎。近年來，蘋果酒越來越受到人們的關(guān)注。蘋果酒營養(yǎng)豐富，富含多種酚類物質(zhì)和有機酸[3-4]，蘋果酒對人體健康有很多積極作用[5]，能夠調(diào)整人體的新陳代謝，具有很強的抗氧化性，同時還具有促進血液循環(huán)、軟化血管、降低血脂等功效[6-7]，經(jīng)常飲用有利于人體健康。隨著人們生活水平的提高，蘋果酒保健功效也越來越被人們認可，蘋果酒產(chǎn)業(yè)也將有廣闊的發(fā)展前景。

山西運城是我國蘋果種植大市，蘋果種植面積 14.82萬hm2，產(chǎn)量380萬t，種植面積占全國的8.3%，產(chǎn)量占全國的10%[8]，當(dāng)?shù)靥O果深加工產(chǎn)業(yè)也較為發(fā)達，蘋果果脯深受廣大消費者歡迎。運城蘋果果脯生產(chǎn)企業(yè)十余家，年產(chǎn)生蘋果果脯廢糖液 8萬t 左右。由于存在轉(zhuǎn)化糖含量較高、顏色太深、pH值偏低和回收處理工序較為復(fù)雜等問題，企業(yè)對廢糖液采取直接廢棄處理，造成巨大的資源浪費和一定的環(huán)境污染。蘋果果脯廢糖液富含多種維生素、礦物質(zhì)、蘋果多酚、水溶性膳食纖維和蘋果芳香酯類物質(zhì)，筆者以企業(yè)產(chǎn)生的蘋果果脯廢糖液和濃縮蘋果汁為原料，采用響應(yīng)面法對蘋果酒生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，以期提高蘋果果脯加工過程中的原輔料利用率，減少環(huán)境污染，提高果脯蜜餞類企業(yè)經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料 濃縮蘋果汁(可溶性固形物含量68.6%)，陜西海升果業(yè)有限公司運城分公司；蘋果果脯廢糖液，山西澤源食品有限公司。

1.1.2 試劑 沒食子酸標準品，中國食品藥品檢定研究院；食品級豬皮明膠，山東淄博寶恩生物科技有限公司；殼聚糖、檸檬酸鈉、檸檬酸、焦亞硫酸鈉、福林酚、氫氧化鈉、酚酞、碳酸鈉、1，1-二苯基-2-苦苯肼(DPPH)、無水乙醇、鄰二氮菲、鄰苯三酚以及其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；GNP-9160隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TD-45數(shù)顯糖度計，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；754型紫外可見分光光度計，上海菁華科技有限公司；CPA124S型電子天平，德國SARTORIUS公司；微量移液器，芬蘭Dragonmed公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；HH-Z2恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘋果果脯廢糖液檢測指標 蘋果果脯廢糖液含糖量較高，高濃度糖液能夠抑制微生物生長，但酵母菌和霉菌耐糖性較強，若貯存不當(dāng)，仍會引起腐敗變質(zhì)，廢糖液測定結(jié)果顯示，蘋果果脯廢糖液感官特性呈現(xiàn)為黑褐色濃稠狀，有蘋果香味，有酸澀味，過甜；廢糖液可溶性固形物含量為74.2%；廢糖液總糖含量為62.5%；廢糖液黏度(25 ℃、200 mL廢糖液流下時間)為285 s；廢糖液中SO2含量為82 mg/L；廢糖液中菌落總數(shù)為300 CFU/mL。可見蘋果果脯廢糖液可以作為輔料發(fā)酵制備蘋果酒。

1.2.2 蘋果酒生產(chǎn)工藝流程及操作要點[9-12]蘋果酒生產(chǎn)工藝流程如下：

1.2.2.1 調(diào)糖度 果酒生產(chǎn)過程中一般通過補加白砂糖或蜂蜜調(diào)整發(fā)酵糖度，本研究通過添加蘋果果脯廢糖液調(diào)節(jié)糖度。以1.7 g糖經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)1%乙醇計算[6]，在充分考慮發(fā)酵轉(zhuǎn)化率的基礎(chǔ)上，初始糖度控制在20～30°Brix。

1.2.2.2 調(diào)節(jié)SO2在果酒生產(chǎn)過程中添加偏重亞硫酸鈉可以有效抑制雜菌的生長和繁殖，起到護色作用[13-14]，提高果酒品質(zhì)穩(wěn)定性。蘋果果脯加工過程中一般會使用偏重亞硫酸鈉進行護色，因此，廢糖液中也有偏重亞硫酸鈉殘留。通過添加偏重亞硫酸鈉調(diào)整果汁中SO2含量為40～80 mg/L。

1.2.2.3 調(diào)節(jié)pH值 酵母發(fā)酵的最適pH值為4.0左右[6，15-16]，調(diào)整pH值為3.5～4.5。

1.2.2.4 接種 接種筆者篩選的D7高產(chǎn)乙醇酵母菌，采用10%乙醇選擇性富集方法，從蘋果皮和蘋果果脯廢糖液中富集和分離的185株菌經(jīng)過三級篩選選出D7高產(chǎn)乙醇酵母菌[17]，接種量為3%～5%。

1.2.2.5 發(fā)酵 控制發(fā)酵溫度為20～30 ℃，發(fā)酵時間為8～12 d，終止發(fā)酵。

1.2.2.6 澄清 為了保證酒體的穩(wěn)定性，采用澄清劑的方法對酒體進行澄清。取5 g食品級豬皮明膠，溶于100 mL 50 ℃ 蒸餾水中，制成5%明膠溶液；取1 g殼聚糖，溶于 100 mL 0.1%檸檬酸溶液中，加熱煮沸至完全溶解，制成1%殼聚糖溶液。分別添加0.5%明膠溶液和0.1%殼聚糖溶液，混合均勻，靜置48 h，倒罐除去沉淀。

1.2.2.7 通氣 蘋果酒發(fā)酵過程中會有大量二氧化碳放出，伴隨溫度升高、糖度下降、乙醇度和酸度升高等現(xiàn)象，短時間的通氣或放氣有利于酵母繁殖增長和二氧化碳的放出，保證發(fā)酵順利進行[18]。為了防止雜菌污染，應(yīng)減少蘋果酒與空氣接觸時間，通氣頻率控制為1～3 d通氣1次。

1.2.3 指標測定方法 乙醇度測定采用乙醇蒸餾的方法[19]；糖度通過手持糖度儀測定；酸度采用酸堿滴定的方法測定，以酚酞作為指示劑，用NaOH溶液進行滴定，根據(jù)消耗的NaOH溶液量計算總酸含量。

1.2.4 多酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu法測定多酚含量[20]，吸取1 mL備測蘋果酒溶液，用蒸餾水稀釋至10 mL。取1 mL稀釋液，加到10 mL容量瓶中，加入5.0 mL 10%福林酚試劑，搖勻后反應(yīng)6 min。加入4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容，搖勻，常溫靜置1 h，待測。

1.2.5 蘋果酒發(fā)酵因素篩選試驗設(shè)計 研究發(fā)現(xiàn)，蘋果酒發(fā)酵過程中的影響因素包括發(fā)酵液初始pH值、糖度、有效SO2含量、菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、通氣頻率[3-4，10-13]。應(yīng)用Design-Expert軟件對蘋果酒發(fā)酵試驗進行Plackett-Burman(PB)設(shè)計，并對發(fā)酵的7個因素進行篩選，外加4個虛擬變量。每個變量分別確定(+)和(-)2個水平，進行12次試驗以確定其影響因子，線性模型方程式[21]為

Y=β0+∑βixi，(i=1，2，…，k)。

(1)

試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計因素水平

1.2.6 蘋果酒發(fā)酵優(yōu)化試驗設(shè)計 應(yīng)用Design-Expert軟件，采用中心組合設(shè)計(central composite design，CCD)方法，對PB法篩選出的3個重要因素(糖度、接種量、發(fā)酵溫度)進行試驗設(shè)計，同時固定其他非關(guān)鍵因素[6，15，17，22]：pH值4.0，有效SO2添加量80 mg/L，發(fā)酵時間12 d，通氣頻率1次/d。中心組合設(shè)計因素水平見表2。

表2 中心組合設(shè)計因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果

通過蘋果酒發(fā)酵后乙醇度回歸性分析，得到各影響因子的偏回歸系數(shù)及顯著性，PB試驗設(shè)計結(jié)果見表3、表4。

從表4可以看出，因素X1、X2、X4、X5、X6、X7、X8對蘋果酒多乙醇度的影響為正效應(yīng)，即增大正效應(yīng)因素的值，蘋果酒乙醇度呈增加趨勢；因素X3、X9、X10、X11對蘋果酒乙醇度的影響為負效應(yīng)，即隨著負效應(yīng)因素的減小，蘋果酒乙醇度呈降低趨勢。因素X2(糖度)、X4(接種量)、X5(發(fā)酵溫度)為主要影響因素，其貢獻值分別為 50.86%、17.60%、14.25%，而4個虛擬因素對蘋果酒乙醇度影響值分別為0.044%、0.70%、0.18%、0.40%，表明得到的線性回歸方程是可用的。以蘋果酒乙醇度為響應(yīng)值得到的線性回歸方程為

乙醇度=8.62+0.57X2+0.33X4+0.30X5。

(2)

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果

表4 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析

注：E表示的是影響水平，當(dāng)E為正時，該因素對試驗結(jié)果為正影響；當(dāng)E為負時，該因素對試驗結(jié)果為負影響。

從表5可以看出，方差分析模型的P值為 0.002 0，表明所得回歸性方程達到極顯著，即該模型在整個研究區(qū)域擬合得很好。R2=0.827 1，表明相關(guān)性很好；精密度為10.273，本試驗設(shè)計合理。

表5 蘋果酒乙醇度回歸模型方程的方差分析

2.2 CCD優(yōu)化設(shè)計結(jié)果與響應(yīng)面分析

通過對糖度、接種量和發(fā)酵溫度進行中心組合設(shè)計(CCD)(表6)，得到相應(yīng)的二次方程模型：

Y=9.86+0.81A+0.51B-0.37C+0.15AB-0.013AC-0.082BC-0.52A2-0.95B2-0.17C2。

(3)

式中：Y為響應(yīng)值，即蘋果酒乙醇度；A、B、C分別為蘋果酒發(fā)酵過程中發(fā)酵液初始糖度、接種量、發(fā)酵溫度。

對試驗結(jié)果進行擬合的二次模型方差分析，分析結(jié)果見表7。F值為6.33，R2=0.890 5，回歸方程達到顯著水平(P<0.05)，且失擬項不顯著，說明該模型預(yù)測值與實際試驗值擬合較好，可以利用該回歸方程對結(jié)果進行分析，對響應(yīng)值進行預(yù)測。

表6 中心組合設(shè)計及結(jié)果

表7 中心組合設(shè)計二次模型方差分析

從表8可以看出，二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗表明，因素A(糖度)對蘋果酒發(fā)酵乙醇度影響極顯著，因素B(接種量)、因素C(發(fā)酵溫度)對蘋果酒發(fā)酵乙醇度影響顯著；AB、AC、BC對乙醇度的交互影響不顯著；因素A2、B2對乙醇度的曲面效應(yīng)顯著，因素C2對乙醇度的曲面效應(yīng)不顯著。利用Design-Expert 8.0軟件在設(shè)定的因素水平內(nèi)對回歸方程進行數(shù)學(xué)規(guī)劃，得到乙醇度最高的優(yōu)化組為糖度 27.70°Brix，接種量5.78%，發(fā)酵溫度26.81 ℃。在此條件下，蘋果酒發(fā)酵乙醇度預(yù)測值為10.524°。

2.3 驗證試驗

在蘋果酒最佳發(fā)酵條件下，即發(fā)酵液初始pH值為4.0、糖度為28°Brix、有效SO2含量為80 mg/L、菌種接種量為6.0%、發(fā)酵溫度為27 ℃、發(fā)酵時間為12 d、通氣頻率為 1次/d，進行蘋果酒發(fā)酵驗證試驗，實測蘋果酒發(fā)酵結(jié)束后乙醇度為10.3°，與預(yù)測值10.524°較接近，預(yù)測精度達97.87%，證明了PB和CCD方法連用優(yōu)化蘋果果酒發(fā)酵條件具備一定的可行性和準確性。

表8 二次模型回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

2.4 蘋果酒抗氧化性研究

3 討論與結(jié)論

蘋果果脯廢糖液含糖量較高，可溶性固形物含量在70%以上，同時富含多種天然維生素、礦物質(zhì)、多酚類物質(zhì)、水溶性膳食纖維和蘋果芳香酯類物質(zhì)等成分，是發(fā)酵制備蘋果酒的理想原料。以蘋果果脯廢糖液作為蘋果酒生產(chǎn)的主要原料，能降低蘋果酒生產(chǎn)成本，增加蘋果果脯生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟效益，同時避免廢糖液對環(huán)境造成污染。

蘋果果脯廢糖液顏色較深，紀陽等采用活性炭+大孔樹脂混合恒溫浸漬方式聯(lián)合脫色劑對無花果果脯蜜餞褐變糖液脫色[28]，高振鵬等采用活性炭吸附法對獼猴桃果脯廢糖液進行脫色，處理效果較為理想[29]。作為蘋果酒發(fā)酵原料，本研究未進行脫色處理，生產(chǎn)出的蘋果酒呈現(xiàn)黃色色澤，產(chǎn)品感官品質(zhì)良好。

通過PB設(shè)計，對蘋果酒發(fā)酵的7個因素進行篩選，包括發(fā)酵液初始pH值、糖度、有效SO2含量、菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、通氣頻率，并確定發(fā)酵糖度、菌種接種量、發(fā)酵溫度3個因素為主要影響因素，且這3個因素對蘋果酒乙醇度影響能力依次降低。衛(wèi)春會等經(jīng)過工藝優(yōu)化，證明蘋果酒發(fā)酵影響因素排序為發(fā)酵糖度>接種量>發(fā)酵時間[6]，范兆軍研究表明，蘋果酒發(fā)酵影響因素排序為起始糖度>發(fā)酵溫度>接種量>SO2添加量[22]，上述結(jié)論與本研究結(jié)果基本相同。通過CCD優(yōu)化設(shè)計，優(yōu)化得到蘋果酒發(fā)酵條件為發(fā)酵液初始pH值4.0、糖度28°Brix、有效SO2含量80 mg/L、菌種接種量6.0%、發(fā)酵溫度27 ℃、發(fā)酵時間12 d、通氣頻率 1次/d，發(fā)酵蘋果酒乙醇度為 10.3°，確定蘋果酒二次方程模型為Y=9.86+0.81A+0.51B-0.37C+0.15AB-0.013AC-0.082BC-0.52A2-0.95B2-0.17C2。

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