謝 昆，蔣成硯，劉 杰，李橋善，周文樹(shù)，唐秀華，汪 鏡

(1.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661199；2.云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南蒙自 661199)

奶牛乳房炎是奶牛高發(fā)病之一，極大地影響了奶牛業(yè)發(fā)展[1]，根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為臨床型、非臨床型2種。其中，非臨床乳房炎即隱性乳房炎，最主要是奶牛隱性乳房炎[2]，導(dǎo)致奶牛隱性乳房炎的病原菌主要有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌等，其中大腸桿菌較為重要[3]。目前，奶牛乳房炎的治療主要靠抗生素，但是經(jīng)過(guò)時(shí)間積累，大量使用或者濫用抗生素現(xiàn)象較為突出，導(dǎo)致抗生素大量殘留在奶牛體內(nèi)，最終導(dǎo)致其產(chǎn)生耐藥菌株[4]。因此，盡早診斷出導(dǎo)致奶牛隱性乳房炎的病原菌，對(duì)人類(lèi)健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展至關(guān)重要[5]。奶牛隱性乳房炎不僅給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失，而且牛奶也因?yàn)槟膛；疾《蛊錉I(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降，甚至當(dāng)人類(lèi)食用帶有病原菌的牛奶后會(huì)給人類(lèi)健康帶來(lái)巨大威脅[6-7]。本研究在生理生化初步鑒定的基礎(chǔ)上，提取病原菌DNA，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測(cè)奶樣中大腸桿菌16S rRNA，并與GenBank中發(fā)表的16S rRNA序列進(jìn)行比較，以便建立一種檢測(cè)奶樣中大腸桿菌的分子生物學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

經(jīng)過(guò)生理生化鑒定的大腸桿菌為筆者所在實(shí)驗(yàn)室從奶樣中分離保存。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)中，將經(jīng)過(guò)生化鑒定并進(jìn)行純化培養(yǎng)后初步確定的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)液中，再將培養(yǎng)液放置在37 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后提取細(xì)菌DNA。

1.3 細(xì)菌DNA提取

應(yīng)用CTAB結(jié)合SDS法提取大腸桿菌DNA，取5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA含量。

1.4 大腸桿菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上發(fā)表的大腸桿菌16S rRNA序列(NC002695)，應(yīng)用Primier premier 5 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，引物序列如下：P1，5′-GAATCACAAAGT GGTAAGCGC-3′；P2，5′-TCGAACAATAACAGGAAACAGC-3′，以提取的細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，49.7 ℃退火1 min，72 ℃延伸100 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，取5 μL樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 PCR產(chǎn)物的測(cè)序和分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到深圳華大基因科技服務(wù)有限公司，完成正反測(cè)序，序列結(jié)果運(yùn)用DNAStar軟件進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌DNA的提取

細(xì)菌DNA經(jīng)CTAB結(jié)合SDS法提取后于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，細(xì)菌DNA約為21 000 bp(圖1)。

2.2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2，從圖2可以看出，PCR產(chǎn)物約為1 400 bp，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.3 序列同源性對(duì)比

PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中大腸桿菌16S rRNA基因序列(NC002695)進(jìn)行同源性對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)二者序列相似性為96%，同源性對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖3。

3 討論與結(jié)論

細(xì)菌基因組DNA提取方法較多，有SDS法、CTAB法[8]、傳統(tǒng)DNA抽提法、加熱煮沸發(fā)、試劑盒抽提法、chelex 100法。 本研究利用SDS、CTAB混合法提取細(xì)菌基因組DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可看到細(xì)菌DNA提取過(guò)程中無(wú)污染，瓊脂糖凝膠條帶中無(wú)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明細(xì)菌提取的基因組DNA較為完整。

16S rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中，具有較高的保守性，由于16S rRNA基因核苷酸序列總長(zhǎng)度適宜，結(jié)構(gòu)完整，更便于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行各種研究。因此設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以 16S rRNA 為靶分子在適當(dāng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，便得到擴(kuò)增后的16S rRNA片段，將擴(kuò)增后的16S rRNA基因序列與基因庫(kù)中的片段比對(duì)，便可以知道未知菌與其他菌的同源性，從而完成對(duì)菌的鑒定。

[1]李永安.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及防制研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[2]程振濤.奶牛隱性乳房炎的診斷方法與細(xì)菌學(xué)研究[D].貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2006.

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