劉虹秀，程玉笛，黨光輝，李田田，李 鶴，崔子寅，宋寧寧，陳利蘋，劉思國

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/動物細菌病創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱150069)

副結核病(Paratuberculosis)又稱為副結核性腸炎，是由副結核分枝桿菌(Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis，MAP)引起的反芻動物的慢性消化道疾病，該病以頑固性腹瀉、漸進性消瘦、腸黏膜增厚并形成皺襞為特征。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須通報的動物疫病，我國將其列為B類疫病。根據(jù)菌株的培養(yǎng)特性及致病力將MAP分為牛型、羊型和生物中間型3個亞型[1]。副結核病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，近年來我國發(fā)病率也呈上升趨勢[2]，給乳制品和牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，因此受到各國的高度重視，并投入大量人力、財力研究其防治措施[3]。

MAP的分離鑒定對了解我國奶牛副結核病的流行特點及病原學研究均具有重要意義，本研究采集新疆某奶牛場產(chǎn)奶量下降、腹瀉消瘦疑似副結核病患牛的直腸刮取物，對其進行分枝桿菌的分離培養(yǎng)及抗酸染色，應用分枝桿菌種及型特異性PCR方法和序列分析，對分離株進行種和亞型的鑒定，確定了3株分離菌為牛型副結核分枝桿菌，為進一步研究副結核病的流行病學和病原學奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料MAP k10標準株由本實驗室保存；鳥分枝桿菌CVCC277購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；新疆某牛場疑似副結核病牛的直腸刮取物樣品37份；氯代十六烷基吡啶(HPC)、萘啶酮酸鈉鹽(naladixic acid)、萬古霉素、兩性霉素B購自美國Sigma公司；腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、7H9液體培養(yǎng)基購自美國BD公司；細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Premix ExTaqDNA Polymerase購自TaKaRa公司。

1.2 引物設計 多重PCR引物(IS900、IS901、DT1、IS1311、16S rRNA gene)[4]、MAP分型鑒定引物(DMC529、DMC531、DMC533)[5]，均由哈爾濱博仕生物技術公司合成(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primers used in the study

1.3 直腸刮取物樣品處理 采用改良的NADC[6]法，稱取直腸刮取物樣品1 g～2 g加入35 mL滅菌雙蒸水中震蕩，室溫靜置30 min后吸取全部上清經(jīng)1 700 r/min離心20 min后棄掉上清，沉淀用含0.95%氯代十六烷基吡啶(HPC)的BHI培養(yǎng)基，即HPC-BHI溶液30 mL重懸，37℃孵育過夜。1 700 r/min離心20 min后棄上清，沉淀用1 mL混合抗生素液(100μg/mL naladixic acid；100μg/mL萬 古 霉素；50μg/mL兩性霉素B)重懸，37℃放置過夜，取0.2 mL懸液接種卵黃瓊脂培養(yǎng)管(含50μg/mL naladixic acid；50μg/mL萬古霉素)。

1.4 細菌的分離培養(yǎng)及與抗酸染色鏡檢 培養(yǎng)時先將接種后的卵黃瓊脂培養(yǎng)基傾斜放置于37℃溫箱培養(yǎng)1～2周，然后將培養(yǎng)基豎直放置，繼續(xù)培養(yǎng)，每周查看培養(yǎng)基生長情況和污染狀況，直至第12周。觀察菌落形態(tài)，進行抗酸染色并在顯微鏡下觀察染色結果。

1.5 3株分離菌的多重PCR鑒定 挑取單菌落接種于7H9液體培養(yǎng)基中，37℃搖床100 r/min培養(yǎng)8周，之后采用試劑盒提取細菌基因組DNA。以IS900、IS901、DT1、IS1311、16S rRNA gene 5對引物對分離菌進行多重PCR鑒定，反應程序：95℃8 min；95℃60 s、60℃40 s、72℃35 s，29個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。多重PCR的5個產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上很容易區(qū)分，其中16S rRNA基因?qū)λ蟹种U菌具有特異性，可以擴增出484 bp的產(chǎn)物，MAP的IS900基因具有特異性，PCR可擴增出398 bp的產(chǎn)物，IS901是鳥分枝桿菌特異性基因，可擴增出753 bp的產(chǎn)物，296 bp的產(chǎn)物來自鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的特異性基因DT1，所有鳥分枝桿菌亞種均可擴增出IS1311基因的608 bp的產(chǎn)物。

1.6 MAP亞 型 鑒 定 以DMC529、DMC531、DMC533為引物進行MAP亞型鑒定，反應程序：95℃3 min；95℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，25個循環(huán)；72℃7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測定并對PCR結果比對分析。

2 結果與討論

2.1 細菌的分離培養(yǎng)與抗酸染色鏡檢 經(jīng)處理的37份直腸刮取物樣品經(jīng)過5～14周培養(yǎng)后，其中7份樣品在含分枝桿菌素的卵黃瓊脂培養(yǎng)基上長出菌落，初始菌落很小(直徑1 mm)，無色半透明半球狀，邊緣整齊，表面光滑，有光澤，隨著培養(yǎng)時間延長，菌落變大(4 mm～5 mm)不透明，菌落的形態(tài)從光滑變粗糙，從半球狀變?yōu)槿轭^狀。挑取單菌落進行抗酸染色，在顯微鏡下可觀察到紅色略彎曲的細長桿菌，呈單個或分支狀排列，符合分枝桿菌的形態(tài)學特征及抗酸染色特性(圖1)，表明所分離培養(yǎng)的7株分離菌均為抗酸染色陽性菌。

圖1 副結核分枝桿菌分離株抗酸染色結果Fig.1 Acid-fast staining of the M.paratuberculosis isolates

2.2 分枝桿菌種的多重PCR鑒定 提取7株分離菌的基因組為模板進行多重PCR擴增，結果顯示，利用多重PCR方法鑒定的7株分枝桿菌中有3株分離菌擴增得到約400 bp、500 bp、600 bp 3條特異性條帶，分別對應IS900、16S rRNA、IS1311 3個基因，與MAP陽性對照k10標準株一致，表明該3株分離株為MAP(圖2)，分別命名為MAP-XJB01、MAP-XJB13、MAP-XJB37。

圖2 副結核分枝桿菌分離株多重PCR檢測結果Fig.2 Detection of the M.paratuberculosis isolates by multiplex PCR

2.3 MAP的亞型鑒定 用亞型特異性DMC529、DMC531、DMC533引物對已鑒定為MAP的3株分離菌進行PCR擴增分型。結果顯示，3株MAP的DNA均擴增得到約300 bp的預期產(chǎn)物(圖3)，將PCR產(chǎn)物進行測序分析，參照Collins[5]發(fā)表的鑒定MAP牛型和羊型的方法，通過Blast進行序列比對，測序所得的序列與報道的牛型MAP的序列同源性為100 %，確定本研究分離培養(yǎng)的3株MAPXJB01、MAP-XJB13、MAP-XJB37均為牛副結核分枝桿菌。MAP的不同亞型在流行上存在差異，已經(jīng)在牛和其它物種中發(fā)現(xiàn)牛型流行株，而目前羊型流行株僅在綿羊中有報道[7]。造成這種結果可能是由于不同亞型MAP具有一定程度的宿主特異性、偏好性或適應性，在不同條件下有不同的感染方式或環(huán)境存活能力，這些條件傾向于感染一種或其它寄主物種。在實際生產(chǎn)中可以通過加強管理減少不同物種在易感時間內(nèi)的接觸來降低MAP不同亞型在不同物種之間感染傳播的機會。

MAP屬于胞內(nèi)寄生菌，具有較強的環(huán)境和宿主適應性。對于病原學檢測，由于對樣品處理要求高、分離方法復雜、培養(yǎng)周期長，MAP的分離培養(yǎng)一直是個難題，本研究從患牛直腸刮取物中分離到MAP，證明本研究所用的分離培養(yǎng)方法可行，可以為MAP的分離培養(yǎng)提供參考。雖然目前檢測副結核病有糞便培養(yǎng)、抗酸染色、抗體ELISA檢測等多種方法，但由于缺乏準確的檢測及檢測標準，造成很多國家的動物副結核病患病率較難估計。本研究選用的多重PCR檢測方法可以對分枝桿菌進行快速、特異、靈敏的檢測和鑒定，為進一步開展MAP病原學和流行病學研究提供了必要的研究資料。

圖3 副結核分枝桿菌分離株亞型鑒定結果Fig.3 Subtype identification of the M.paratuberculosis isolates