常繼濤，張佳昕，于 力

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/牛羊傳染病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱150069)

輪狀病毒(Rotavirus，RV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)、輪狀病毒屬(Rotavirus)的成員，有7個(gè)不同的群(A～G)。A群RV是各種幼齡動(dòng)物非細(xì)菌性腹瀉的主要病原之一，在世界范圍內(nèi)廣泛流行[1-3]。所引起腹瀉的嚴(yán)重程度差異很大，可表現(xiàn)為隱性帶毒、中等程度的自限性腹瀉以及伴有嚴(yán)重脫水和電解質(zhì)紊亂的重度腹瀉。對于養(yǎng)牛業(yè)，牛輪狀病毒(Bovine rotavirus，BRV)引起的犢牛腹瀉的危害主要體現(xiàn)在治療成本的增加、生長率的降低以及一定的死亡率而導(dǎo)致的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

RV的基因組是分節(jié)段的雙股RNA，由11個(gè)節(jié)段組成，每個(gè)節(jié)段分別編碼一種蛋白。VP6蛋白由RV第6基因節(jié)段編碼，由397個(gè)氨基酸組成，分子量為45 ku，占病毒蛋白的51 %，是病毒粒子中含量最多的結(jié)構(gòu)蛋白，屬內(nèi)衣殼蛋白，是RV的群及亞群抗原[4-6]。在A群RV中，VP6蛋白的編碼基因序列高度保守，而且VP6蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，在RV感染機(jī)體后血清中針對VP6蛋白的抗體最早出現(xiàn)，持續(xù)時(shí)間最長，是用于檢測RV感染的主要靶蛋白[7-9]。

目前診斷RV常用的方法為病毒分離及RT-PCR等。但這些方法普遍存在耗時(shí)長、操作不方便等缺點(diǎn)。因此，建立一種快速、高通量的病原檢測方法是BRV病原學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。本研究以針對VP6蛋白的多克隆抗體為捕獲抗體、以G6/G10共享型單克隆抗體(MAb)1F7為檢測抗體，建立BRV抗原捕獲ELISA方法，為BRV的快速診斷和病原學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Marc145細(xì)胞、分泌G6/G10型BRV MAb的雜交瘤細(xì)胞株1F7、G6型BRV NCDV株、G10型RV LLR-85株、G2和G5型BRV牛腸道病毒(BEV)、牛呼腸孤病毒(BReV)、牛細(xì)小病毒(BPV)、阿卡斑病毒(AKV)、已純化的BRV VP6蛋白多克隆抗體(7.5 mg/mL)均由本實(shí)驗(yàn)室保存；牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)由薛飛研究員提供；雌性BALB/c小鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清均為GIBCO公司的產(chǎn)品；抗體亞類試劑盒購自SouthernBiotech公司；TMB購自天根生化科技(北京)有限公司；DAB、標(biāo)記用辣根過氧化物酶(HRP)購自Solarbio公司；羊抗鼠HRP-IgG、羊抗鼠FITC-IgG購自Sigma公司；DEAE-Sephadex A-50購自GE公司；商品化RV ELISA檢測試劑盒購自博卡生物技術(shù)有限公司。

1.3 G6/G10共享型BRV MAb 1F7的制備、鑒定、純化以及標(biāo)記

1.3.1 MAb 1F7的制備以體內(nèi)誘生法[10]制備腹水的方式生產(chǎn)MAb 1F7。簡述之：將分泌BRV MAb的雜交瘤細(xì)胞株1F7復(fù)蘇培養(yǎng)，調(diào)整狀態(tài)；取10周齡～12周齡雌性小鼠，每只腹腔注射無菌的液體石蠟，一周后腹腔注射5×105個(gè)雜交瘤細(xì)胞；待一周左右小鼠腹部隆起，采集腹水、離心、收集上清，上清中即含有MAb 1F7，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 MAb 1F7的鑒定利用抗體亞類鑒定試劑盒鑒定MAb 1F7的亞類。以1∶500倍稀釋的MAb 1F7為一抗、1∶400倍稀釋的羊抗鼠FITC-IgG為二抗，采用間接免疫熒光(IFA)鑒定MAb 1F7與G2、G5、G6及G10型RV分離株的反應(yīng)性，同時(shí)設(shè)立鼠陰/陽性血清為對照。采用硫氰酸鹽洗脫法[11]，測定MAb 1F7的相對親和力常數(shù)。

1.3.3 MAb 1F7的純化及標(biāo)記采用辛酸-飽和硫酸銨法對MAb 1F7進(jìn)行初步純化[12]，進(jìn)而再經(jīng)DEAE-sephadexa-50層析柱進(jìn)一步純化，并測定濃度。采用改良的過碘酸鈉法對MAb 1F7進(jìn)行HRP標(biāo)記[13]。

1.4 抗原捕獲ELISA方法的建立 采用方陣滴定法確定VP6多抗最佳包被濃度及MAb 1F7的最佳使用濃度(1∶100～1∶3 200)，最佳封閉液(含5 %脫脂乳、1 %明膠、1 % BSA的PBST作為封閉液)，待檢抗原最佳反應(yīng)時(shí)間(30 min、45 min、60 min和120 min)，底物最佳反應(yīng)時(shí)間(5 min，10 min，15 min及30 min)。按建立的最佳工作條件對10份陰性樣品檢測，計(jì)算該方法的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 特異性試驗(yàn) 以BRV、BEV、BPV、AKV、BReV、IBRV、BPIV3以及BVDV為包被抗原，利用建立的抗原捕獲ELISA進(jìn)行檢測，每份抗原做兩個(gè)重復(fù)，同時(shí)做陰、陽性抗原對照，評價(jià)該方法的交叉反應(yīng)。

1.6 敏感性試驗(yàn) 將BRV NCDV株細(xì)胞培養(yǎng)物(TCID50=106.17/0.1 mL)從1∶10做2倍系列稀釋后分別作為包被抗原，按照優(yōu)化后的程序進(jìn)行抗原捕獲ELISA，測定最低病毒檢出量，評價(jià)本實(shí)驗(yàn)建立方法的敏感性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別利用相同批次和不同批次包被的酶標(biāo)板，同時(shí)對不同稀釋倍數(shù)的G6型BRV NCDV株和G10型RV LLR-85株，采用本研究建立的捕獲ELISA進(jìn)行3次檢測，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)公式計(jì)算變異系數(shù)，以確定該方法的重復(fù)性。

1.8 符合性試驗(yàn) 取本實(shí)驗(yàn)室收集于2016年～2017年我國東北部分地區(qū)奶牛場的67份犢牛腹瀉糞便樣品，分別利用商品化BRV抗原捕獲ELISA試劑盒、本研究建立的抗原捕獲ELISA以及RTPCR進(jìn)行檢測[14-15]。比較每種方法檢測BRV的陽性率，確定本研究建立的BRV抗原捕獲ELISA方法與其它方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 MAb 1F7的純化、鑒定以及標(biāo)記 經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨方法對MAb 1F7進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，獲得了較高純度的MAb 1F7，濃度為7.3 mg/mL。純化后的MAb 1F7再經(jīng)DEAEsephadex a-50離子交換層析進(jìn)一步純化，并用改良過碘酸鈉法進(jìn)行HRP標(biāo)記。利用抗體亞類試劑盒鑒定，結(jié)果顯示MAb 1F7是IgG2b/κ型。經(jīng)硫氰酸鹽洗脫法測定，MAb 1F7的相對親和力常數(shù)為0.5 mol/L。將MAb 1F7腹水分別與感染G2、G5、G6及G10型RV的Marc-145細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測，結(jié)果顯示，MAb 1F7僅與G6和G10型病毒株呈陽性反應(yīng)，而與G2和G5型RV無反應(yīng)(圖1)，表明1F7為BRV G6/G10共享型MAb。

圖1 IFA檢測MAb 1F7的反應(yīng)性Fig.1 Detection of the reaction of MAb 1F7 by IFA

2.2 VP6多抗最佳包被濃度和檢測MAb 1F7最佳使用濃度的確定 采用方陣滴定法確定包被抗體VP6多抗和檢測MAb 1F7的最佳使用濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)VP6多抗以1∶1 600倍稀釋(4.68μg/mL)、每孔包被100μL，HRP標(biāo)記后的檢測MAb HRP-1F7 1∶400倍稀釋時(shí)，檢測的P/N值最大。結(jié)果顯示VP6多抗的最佳包被濃度為4.68μg/mL，HRP-1F7的最佳使用濃度為1∶400(表1)。

2.3 抗原捕獲ELISA最佳反應(yīng)條件的確定 本研究建立的抗原捕獲ELISA的最佳反應(yīng)條件見表1。

表1 抗原捕獲ELISA最佳工作條件的確定Table 1 Determination of optimal working condition of the antigen capture ELISA

2.4 抗原捕獲ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 按照上述已確定的抗原捕獲ELISA的最佳反應(yīng)條件，隨機(jī)選取10份陰性樣品進(jìn)行檢測，并計(jì)算其OD450nm平均值()和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，當(dāng)OD450nm值＞+3SD，可以在99.9 %可信度上判定為陽性，能夠作為檢測結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)三次重復(fù)試驗(yàn)，確定判定標(biāo)準(zhǔn)為OD450nm＞0.151為陽性，OD450nm＜0.1335為陰性，介于0.1335～0.151為可疑，需要重新檢測。

2.5 特異性試驗(yàn) 按照已建立的抗原捕獲ELISA檢測方法對BRV、BEV、BPV、AKV、BReV、IBRV、BPIV3以及BVDV進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示僅BRV檢測結(jié)果為陽性，而其余病毒檢測結(jié)果均為陰性(表2)。表明本研究建立的抗原捕獲ELISA方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.6 敏感性試驗(yàn) 將BRV NCDV株細(xì)胞培養(yǎng)液(TCID50=106.17/0.1 mL)從1∶10開始進(jìn)行2倍系列稀釋后以已建立的ELISA方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，本研究建立的抗原捕獲ELISA的病毒最低檢出量為104.2TCID50，而商品化ELISA試劑盒的病毒最低檢出量為104.86TCID50(圖2A)，RT-PCR方法的病毒最低檢出量為103.36TCID50(圖2B)。表明本研究建立的ELISA方法具有較高的敏感性，優(yōu)于商品化試劑盒，但低于RT-PCR方法。

表2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Specificity test of the antigen capture ELISA

圖2 敏感性試驗(yàn)檢測結(jié)果Fig.2 The sensitivity test of the detection methods

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別利用相同批次和不同批次包被的酶標(biāo)板，對不同稀釋倍數(shù)的RV NCDV株和LLR-85株進(jìn)行3次檢測，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)公式計(jì)算變異系數(shù)均小于10 %(表3)，表明該ELISA方法的具有較好的重復(fù)性。

2.8 抗原捕獲ELISA的應(yīng)用與符合性試驗(yàn) 應(yīng)用該ELISA方法對67份牛腹瀉糞便樣品進(jìn)行檢測，陽性率為18 %，與商品化試劑盒和RT-PCR方法的符合率為100 %。但目前所檢測樣品數(shù)量有限，并且樣品來源比較單一。因此，下一步尚需要檢測更多的樣品，以確定最終的符合率。

表3 組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Intra-assay and inter-assay reproducibility test of the antigen capture ELISA

3 討論

由于RV血清型眾多，而且不同血清型之間不能夠完全交叉保護(hù)，因此病原流行病學(xué)調(diào)查是疫苗研究的重要依據(jù)?？乖东@ELISA又稱雙抗體夾心ELISA，該方法已被大量用于動(dòng)物疫病的臨床診斷。國內(nèi)外均已有商品化的人輪狀病毒ELISA抗原檢測試劑盒[16]。而基于MAb的BRV抗原檢測方法目前國內(nèi)尚無報(bào)道，本研究建立了檢測BRV的抗原捕獲ELISA方法，具有較好的特異性、敏感性及重復(fù)性，初步應(yīng)用結(jié)果顯示其可以實(shí)現(xiàn)對現(xiàn)地樣品的快速檢測，為下一步BRV感染的檢測和流行的監(jiān)測、實(shí)驗(yàn)室診斷以及抗原檢測試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

VP7蛋白為BRV的外衣殼蛋白，其含量居病毒結(jié)構(gòu)蛋白的第二位，占病毒蛋白總量的30 %，由RV第9(或7、8依不同病毒株而異)基因節(jié)段編碼，共326個(gè)氨基酸組成，分子量為37 ku，是RV的主要中和抗原，決定病毒的血清型[17]。VP6蛋白是BRV病毒粒子中含量最多的結(jié)構(gòu)蛋白，占病毒蛋白的51 %，屬內(nèi)衣殼蛋白，是RV的群及亞群抗原。本研究建立的抗原捕獲ELISA采用針對保守抗原VP6的多克隆抗體作為包被抗體，可以實(shí)現(xiàn)對抗原的廣譜性捕獲而提高方法的敏感性；采用針對相對易變異的VP7抗原的MAb作為檢測抗體，可提高方法的特異性。試驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示，本研究建立的方法其敏感性、特異性與商品化試劑盒以及RT-PCR方法相差無幾，有些方面還更優(yōu)秀。

對抗原捕獲ELISA而言，包被抗體和檢測抗體的純度極為重要，捕獲抗體的純度直接決定該方法的敏感性，而檢測抗體的純度影響該方法的特異性。在本研究中，對捕獲抗體VP6多抗進(jìn)行了辛酸-硫酸銨法純化，可達(dá)到較高的敏感性；MAb具有特異性強(qiáng)，均質(zhì)性好等特點(diǎn)，因此本研究采用MAb作為檢測抗體，MAb經(jīng)辛酸-包和硫酸銨法和DEAE-sephadex A-50離子交換層析法純化，可獲得高純度抗體，有效提高了方法的特異性。此外，MAb經(jīng)過HRP標(biāo)記，節(jié)省了加二抗的步驟，增加了該方法的簡便性，節(jié)省了檢測時(shí)間，增強(qiáng)了實(shí)用性，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

目前，我國BRV以G6和G10型為主，本研究建立的抗原捕獲ELISA方法的檢測MAb 1F7是G6/G10型共享MAb，并且與G5及G2等其它型RV無交叉反應(yīng)。因此本研究建立的抗原捕獲ELISA方法可實(shí)現(xiàn)對我國BRV的廣譜性檢測，為我國BRV綜合防控技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。