田耕晨，曾文濤

(1.紹興市高級中學(xué)，浙江 紹興 312000； 2.紹興文理學(xué)院，浙江 紹興 312000)

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的組分，作為一種免疫激活劑，常用于免疫學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)中，其在新興的無脊椎動物免疫學(xué)研究方面應(yīng)用較少。已有研究表明，脂多糖對櫛孔扇貝血清和血細(xì)胞中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)的活力有激活加強作用[1]，并可顯著增強櫛孔扇貝血細(xì)胞的吞噬活力[2]。但上述研究僅限于部分海產(chǎn)貝類，有關(guān)三角帆蚌ACP、AKP的相關(guān)報道較為少見[3-4]，尤其是LPS對其活力的影響罕見報道。三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我國特有的淡水育珠蚌，但不當(dāng)?shù)闹仓槭中g(shù)、不良的水體環(huán)境和對河蚌進(jìn)行高密度吊養(yǎng)及不當(dāng)?shù)氖┓蕦?dǎo)致水體富營養(yǎng)化都會導(dǎo)致三角帆蚌抵抗力下降、感染細(xì)菌等疾病[5-6]。本研究以三角帆蚌為試驗材料，注射LPS后，于不同時間測定其血清中ACP、AKP的活力，以探討LPS對三角帆蚌血清中2種水解酶活力影響及其規(guī)律，從而為探討LPS作為免疫激活劑應(yīng)用于淡水育珠蚌的免疫學(xué)研究和疾病預(yù)防提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 三角帆蚌與LPS誘導(dǎo)刺激

三角帆蚌購自諸暨某珍珠養(yǎng)殖場，平均體重約100 g，在經(jīng)曝氣的水族箱(5 m×3 m×2 m)中暫養(yǎng)7 d(22±2)℃。每只蚌于閉殼肌中注射50 μg LPS進(jìn)行誘導(dǎo)刺激(Sigma公司產(chǎn)品，濃度1 μg·μL-1)，試驗組注射等量生理鹽水，設(shè)3個平行。

1.2 血清的準(zhǔn)備

誘導(dǎo)刺激后6、12、24、48、72和96 h，分別用注射器從閉殼肌中抽取血淋巴，于4 ℃ 3 000g下離心10 min，取上清用于ACP、ALP酶活力的測定。

1.3 酶活力的測定

根據(jù)南京建成生物工程研究所的ACP、AKP酶活測定試劑盒說明書，進(jìn)行三角帆蚌血清上ACP和AKP活力的測定。用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計，t檢驗顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS誘導(dǎo)刺激對三角帆蚌ACP活力的影響

在LPS誘導(dǎo)刺激后，分別于6、12、24、48、72和96 h測定三角帆蚌血清中ACP的活力，具體結(jié)果如圖1所示。自LPS誘導(dǎo)刺激6 h起ACP活性快速增強(為對照組的2倍以上)，至48 h達(dá)到峰值(近2.8倍)，隨后又逐漸下降；96 h時，ACP活力基本與6 h時相近。同時在試驗期間所有時間段內(nèi)(6～96 h)，試驗組的ACP活力均顯著高于對照組(P<0.05)，其中48 h時極顯著高于對照組(P<0.01)。表明LPS誘導(dǎo)刺激對ACP活力具激活增強作用。

圖1 LPS誘導(dǎo)刺激對ACP活力的影響

2.2 LPS誘導(dǎo)刺激對三角帆蚌AKP活力的影響

在LPS誘導(dǎo)刺激后，分別于6、12、24、48、72和96 h測定三角帆蚌血清中AKP活力，具體結(jié)果如圖2所示。自LPS誘導(dǎo)刺激6 h起AKP活性逐漸增強，至48 h達(dá)到峰值(為對照組的2.65倍以上)，隨后又逐漸下降；96 h時，AKP活性略高于對照組；12～72 h時，試驗組的AKP活力均顯著高于對照組，其中48 h時極顯著高于對照組(P<0.01)。表明與ACP相似，LPS誘導(dǎo)刺激對AKP活力也具有較強激活增強作用。

圖2 LPS誘導(dǎo)刺激對AKP活力的影響

3 討論

有關(guān)軟體動物免疫機制的研究受到國內(nèi)外關(guān)注[7-10]。已有研究表明，在缺乏特異性免疫球蛋白的軟體動物體內(nèi)，水解酶在清除異物的過程中發(fā)揮了重要作用[10-12]，參與病原微生物、寄生蟲和腫瘤的殺滅和清除等過程。

ACP是溶酶體的標(biāo)志酶。在酸性環(huán)境下，酸性磷酸酶能夠通過水解作用將表面帶有磷酸酯的異物破壞掉，從而達(dá)到預(yù)防感染的目的，并可修飾或改變外來異物的表面分子組成，從而增強血細(xì)胞對異物的識別，起到調(diào)理的作用，加快吞噬細(xì)胞對異物的吞噬和降解速度[13]。同ACP一樣，AKP也是軟體動物溶酶體酶的重要組分，在免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)體內(nèi)的鈣磷代謝和角蛋白分泌，以及軟體動物貝殼的形成等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，在LPS誘導(dǎo)刺激6 h后，三角帆蚌血清中ACP和AKP的活力均逐漸增強，并均與48 h達(dá)到峰值，隨后下降，呈明顯先升后降的趨勢，表明與其他貝類中的研究結(jié)果類似，LPS誘導(dǎo)刺激，對三角帆蚌血清中的ACP、AKP活力有激活加強作用，也證明這兩種水解酶對貝類天然免疫反應(yīng)過程具有重要作用。但LPS刺激后，三角帆蚌血清中2種酶活力的變化稍有差異，ACP活力在試驗期間所有時間段內(nèi)(6～96 h)，試驗組均顯著高于對照組；而AKP活力在12～72 h時，試驗組的AKP活力均顯著高于對照組?？傊狙芯棵鞔_了LPS誘導(dǎo)刺激對三角帆蚌血清中ACP和AKP 2種水解酶活力的刺激增強作用。

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