王天亮，柯 野，謝 璐，唐新蓮,2*

(1.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530005； 2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004)

β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase，EC3.2.1.21)，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶(cellobias，CB或β-G)和苦杏仁苷酶，屬于纖維素酶類，是纖維素分解酶系中的重要組成成分，能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖鍵，同時(shí)釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。β-D-葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界中，它可以來源于植物、微生物，也可來源于動物，其中β-D-葡萄糖苷酶的植物來源有人參、大豆、玉米等[1-2]。

異羥肟酸類化合物(2, 4-二羥基-2H-1, 4-苯并噁嗪-3(4H)-酮，也稱氧肟酸)是禾本科植物重要的次生代謝產(chǎn)物，是一類與植物抗菌、抗蟲和化感作用有關(guān)的植物次生代謝物[3-4]。唐新蓮等[5]研究表明，玉米根、莖、葉器官中均含有異羥肟酸，且鋁誘導(dǎo)的根系分泌異羥肟酸類物質(zhì)可能是一些耐鋁玉米品種抵御鋁毒害的一種機(jī)制。丁布(DIMBOA，2, 4-二羥基-7-甲氧基-1, 4-苯并噁嗪-3-酮)是玉米中最豐富的異羥肟酸類物質(zhì)，在玉米抗性中起到重要作用[3]。門布(MBOA，6-甲氧基-3-苯并噁啉-3-酮)也是玉米中另一種重要的異羥肟酸類物質(zhì)[6]。而β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)在丁布葡萄糖苷(DIMBOA-Glu)水解為有活性的糖苷配基-DIMBOA的過程中起著非常重要的作用，是DIMBOA合成的關(guān)鍵酶[7-9]。所以β-D-葡萄糖苷酶作為丁布合成關(guān)鍵酶對探明玉米耐性(如耐鋁性等)新機(jī)制具有重要意義。

目前β-D-葡萄糖苷酶活性的測定方法主要有3種：一是Barush和Swiain法；二是螢光法；三是以對硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)為底物的分光光度法比色測定[10]。由于β-D-葡萄糖苷酶與pNPG作用釋放出來的對硝基苯可用分光光度法在400～420 nm處測定，具有方法簡單、反應(yīng)快速、反應(yīng)活性大等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛采用[11-12]。但不同來源的β-D-葡萄糖苷酶的氨基酸序列、分子量等差異比較大，其與pNPG作用時(shí)的最適pH值、pH值穩(wěn)定性范圍、最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性范圍上均有很大差別[13]。江昌俊等[10]以對硝基β-D-葡萄糖苷為底物，對茶葉中β-D-葡萄糖苷酶活性測定條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，粗酶提取液底物濃度為10 mmol·L-1，在49 ℃條件下反應(yīng)120 min能得到最大的光吸收值。董尚勝等[12]試驗(yàn)表明，茉莉花中采用37 ℃、反應(yīng)時(shí)間在8 h之內(nèi)，結(jié)果具有穩(wěn)定性，其中反應(yīng)底物的濃度10 mmol·L-1，緩沖液pH 值5.5，測定波長為405 nm[11]。車建美等[12]對尖孢鐮刀菌中的β-D-葡萄糖苷酶活性測定結(jié)果表明，當(dāng)溫度為50 ℃、pH值 5.0、底物濃度達(dá)到 4 mmol·L-1、反應(yīng)時(shí)間為l6 min時(shí)，酶活力達(dá)到最大。目前，有關(guān)以對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷為底物進(jìn)行酶解來測定玉米β-D-葡萄糖苷酶活性的適宜條件尚未建立。本文以玉米品種泰玉11號為研究材料，研究玉米植株中β-D-葡萄糖苷酶測定的最佳條件，包括反應(yīng)底物的濃度、緩沖液pH值、反應(yīng)溫度和時(shí)間等對β-D-葡萄糖苷酶活性的影響，建立快速準(zhǔn)確的β-D-葡萄糖苷酶活性的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

玉米品種為泰玉11號，種子經(jīng)消毒浸種12 h并催芽露白后于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光強(qiáng)度為12 000 lx左右，設(shè)置白天14 h，溫度為28 ℃，晚上10 h，溫度為20 ℃，濕度為70%，取玉米葉片作為試驗(yàn)材料。

所用試劑有0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉-0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖溶液，1 mol·L-1Na2CO3，對硝基苯酚，不同濃度的pNPG。

儀器設(shè)備有萬分之一電子天平、恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)、分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶提取

取玉米樣品0.5 g于冰凍的研缽中，加入等重的PVP，加入5 mL 0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉-0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖溶液，冰浴研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，10 000 r·min-14 ℃離心10 min，取其上清液作為反應(yīng)的酶液備用。

1.2.2 β-D-葡萄糖苷酶活性測定

參考車建美等[12]的酶測定方法略作修改。取0.1 mL適度稀釋的酶液，加入0.9 mL的0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉-0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖溶液，在恒溫水浴鍋中預(yù)熱一定時(shí)間，加入已預(yù)熱10 min的pNPG底物溶液1 mL，10 min后立即加入1 mol·L-1Na2CO3溶液1 mL終止反應(yīng)，室溫放置5 min，測定消光值D。以加熱失活的酶液按同樣方法處理作空白對照。

酶活單位定義為每1 mL酶液1 min水解1 μmol·L-1pNPG的酶活力為一個(gè)酶活單位U。

酶活計(jì)算公式：酶活性=(Y×V2×V)/(K×V1×M×T)。

其中：K為 對 硝 基 苯 酚 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 的斜率；V為提取酶液總量(mL)；Vl為反應(yīng)體系中酶液量(mL)；V2為反應(yīng)液總量(mL)；M為樣品鮮重(g)；Y為酶促反應(yīng)的吸光值；T為反應(yīng)的時(shí)間(min)。

對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。稱取55.664 mg標(biāo)準(zhǔn)物對硝基苯酚，以蒸餾水溶解定容至1 L容量瓶中，此溶液的濃度為400 μmol·L-1。然后以1 mol·L-1Na2CO3溶液作為溶劑，吸取10 mL 400 μmol·L-1的對硝基苯酚溶劑稀釋至100 mL，此時(shí)溶液濃度為40 μmol·L-1，以此溶液為準(zhǔn)，進(jìn)行等比稀釋，分別得到濃度為20、10、5、2.5 μmol·L-1對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，以1 mol·L-1Na2CO3溶液作為空白對照，按照酶測定波長進(jìn)行測定，得到每個(gè)濃度對應(yīng)的吸光值D，然后以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)置

特征吸收波長的確定。用1 mol·L-1Na2CO3溶液配制20 μmol·L-1對硝基苯酚溶液，然后利用分光光度計(jì)中光譜掃描在波長390～420 nm每隔2 nm波長掃描，以確定對硝基苯酚的最大吸收峰的波長。

緩沖溶液pH值的確定。配制pH值分別為3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4的0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉-0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖溶液，用其提取β-D-葡萄糖苷酶，以確定適合的pH值。

反應(yīng)底物濃度的選擇同。采用試驗(yàn)得到的最適pH值的緩沖溶液，分別加入1 mL濃度為2.5、5、10、20、40 mmol·L-1的底物pNPG溶液，反應(yīng)溫度45 ℃，其他反應(yīng)條件同上述測定方法保持一致，在試驗(yàn)得到的最適吸收波長下測定β-D-葡萄糖苷酶活性，最終根據(jù)酶活選擇反應(yīng)底物的濃度。

反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度的選擇。采用試驗(yàn)得到最適pH值的緩沖溶液，以及最適底物pNPG溶液濃度，設(shè)定反應(yīng)溫度分別為35、40、45、50、55、60 ℃，反應(yīng)時(shí)間分別為10、20、30、40 min，其他條件與上述測定方法保持一致，在試驗(yàn)得到的最適吸收波長處測定消光值D，以確定最適溫度與時(shí)間組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo)，以消光值D為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.019x-0.002，相關(guān)系數(shù)r2=0.999，對硝基苯酚與消光值成線性關(guān)系，因此樣品中β-D-葡萄糖苷酶水解底物(β-D-葡萄糖苷，簡稱pNPG)生成的對硝基苯酚量可以根據(jù)生成的對硝基苯酚的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得出。

圖1 對硝基苯酚光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 吸收波長的選擇

圖2為20 μmol·L-1的對硝基苯酚溶液在390～420 nm可見光范圍內(nèi)的光譜掃描結(jié)果。從圖中可以看出，對硝基苯酚在390～420 nm可見光范圍內(nèi)有特征吸收峰值，且在402 nm處有最大吸收值，因此402 nm是最適測定波長。

圖2 對硝基苯酚波長掃描

2.3 緩沖液pH值對酶活性的影響

每種酶都有其最適pH值，且在不同的植物中其最適pH值有所差異，酶在最佳pH值時(shí)能夠表現(xiàn)出最大的酶活力。圖3為不同pH值緩沖液對酶提取和酶測定的影響。從圖3可見，在其他條件保持一致的情況下，用pH值分別為3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4的0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉-0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖溶液提取和測定β-D-葡萄糖苷酶酶活性時(shí)，當(dāng)緩沖液pH值為4.8時(shí)，β-D-葡萄糖苷酶酶活性表現(xiàn)最高，因此緩沖液pH值 4.8是提取和測定β-D-葡萄糖苷酶的最佳pH值。

圖3 緩沖液pH對β-D-葡萄糖苷酶活性的影響

2.4 底物濃度對β-D-葡萄糖苷酶酶活性的影響

酶反應(yīng)體系中底物與酶濃度比值影響著酶反應(yīng)速度。本試驗(yàn)為了確定玉米中β-D-葡萄糖苷酶的反應(yīng)底物濃度，設(shè)置了一系列pNPG底物濃度分別與酶反應(yīng)，結(jié)果如圖4。從圖4中可見，在底物濃度為2.5～10 mmol·L-1時(shí)β-D-葡萄糖苷酶的酶活性隨著底物濃度的增加而增加，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到20 mmol·L-1時(shí)，酶活性不再增加，表明當(dāng)反應(yīng)底物濃度為10 mmol·L-1時(shí)已經(jīng)達(dá)飽和，因此10 mmol·L-1為底物pNPG(對硝基苯β-D-葡萄糖苷)的最佳反應(yīng)濃度。

圖4 底物濃度對β-D-葡萄糖苷酶活性的影響

2.5 反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對β-D-葡萄糖苷酶酶活性的影響

在酶的催化作用中，反應(yīng)溫度會影響著酶的反應(yīng)速度。從圖5中可以看出，隨著酶促反應(yīng)時(shí)間的延長，各溫度的酶活呈上升趨勢。其中溫度為40 ℃的酶活性上升速度快，溫度為30和50 ℃的酶活上升速度最緩慢，而溫度為35和45 ℃酶反應(yīng)速度居中。酶促反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，各溫度下的β-D-葡萄糖苷酶活性差異不大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為20 min時(shí)，酶促反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)酶活性最大且與其他溫度的酶活差異大，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，溫度為40 ℃的酶活不斷與其他各溫度下的酶活差距越來越大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)，酶活差距最大，因?yàn)榉磻?yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)時(shí)間 40 min之前的酶活性與時(shí)間線性好?？梢娮钸m反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的組合為40 ℃與40 min，是玉米β-D-葡萄糖苷酶活性測定的最佳溫度和時(shí)間組合。

圖5 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對β-D-葡萄糖苷酶活性

3 討論

β-D-葡萄糖苷酶是玉米植株中丁布合成的關(guān)鍵酶，而丁布是玉米抗蟲、抗病的重要次生代謝物質(zhì)。目前測定β-D-葡萄糖苷酶活性的方法大多用分光光度法，但不同來源的β-D-葡萄糖苷酶與pNPG作用時(shí)的最適pH值、pH值穩(wěn)定性范圍、最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性范圍上均有很大差別。茶葉[10]、茉莉花[11]、尖孢鐮刀菌中[12]等β-D-葡萄糖苷酶活性的測定已見報(bào)道，但條件控制各有不同。本研究關(guān)于對硝基苯酚在390～420 nm可見光范圍內(nèi)有特征吸收峰值的掃描結(jié)果表明：對硝基苯酚在402 nm處有最大吸收值，因此402 nm是最適測定波長。另外，本試驗(yàn)通過緩沖液pH值、底物濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對酶活性影響的系列試驗(yàn)得出：當(dāng)反應(yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)時(shí)間為40 min、緩沖液pH值為4.8、反應(yīng)底物pNPG的濃度為10 mmol·L-1、測定波長為402 nm時(shí)，β-D-葡萄糖苷酶的活力達(dá)最大。

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