詹昕燁

(臺州市第一中學，浙江 臺州 318000)

蘭科(Orchidaceae)是高等植物的第二大科，在全球各地均有分布，約有700屬20 000余種，其中蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)、大花無柱蘭(Amitostigmapinguiculum)、長瓣兜蘭(Paphiopedilumdianthum)和細葉石仙桃(Pholidotacantonensis)等多個物種是著名的藥用植物和觀賞性珍貴花卉[1]。細葉石仙桃隸屬蘭科石仙桃屬(Pholidota)，又名小石仙桃、果上葉和巖豆等。全草均可入藥，具有清熱涼血、滋陰潤肺和消腫止痛等功效[2-3]。內生菌一詞最早由De Bary[4]提出，指生活在健康植物組織內的微生物，包含內生真菌、內生細菌和放線菌等。100多年前，人們首次發(fā)現(xiàn)了植物內生菌的存在[5]。內生菌具有十分豐富的生物多樣性，一種植物體內通?？煞蛛x得到數(shù)十種甚至數(shù)百種內生菌[6]。Arnold等[7]對巴拿馬中部雨林2種植物葉片的內生菌進行分析，結果發(fā)現(xiàn)分離自83個健康葉片的內生菌多達972個形態(tài)學種。

植物內生細菌是一類在植物組織內部生存，對宿主沒有傷害的微生物，對植物的生長發(fā)育有一定促進作用，尤其對種子萌發(fā)、增強植株抗逆性有較好的生物學功能，在蘭科植物生活史中具有不可忽視的作用[8-9]。細菌進入植株體內的方式有很多，其中，植物的氣孔、皮孔和傷口等處都是入宿的通道[10-11]。經多年研究發(fā)現(xiàn)，感染內生細菌的植物往往比未感染的植株具有更強的適應性，對環(huán)境脅迫的抗逆性強、他感作用強，且生長速度快，產量高。陳麗梅等[12]對甘蔗(Subtrib saccharinae)體內的重氮營養(yǎng)醋桿菌進行研究，發(fā)現(xiàn)甘蔗吸收的氮素80%可能來自生物固氮，只有少數(shù)來自人工施加的化學氮肥。潘麗晶等[13]對蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)根部內生細菌進行研究，發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭根內生長著可分泌吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)的內生細菌。這些實驗也證明了植物內生細菌具有增強對必需元素的吸收和產生植物促生物質等功能，解釋了植物生長速度加快的原因。近年來，對植物內生細菌的研究報道較多，但有關細葉石仙桃內生細菌的研究尚未見報道。本實驗以細葉石仙桃為研究對象，在分離內生細菌的基礎上，采用分子生物學方法進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

細葉石仙桃樣品采自樂清雁蕩山、臨海白巖山和黃巖劃巖山，剪取假鱗莖帶回實驗室，用大量自來水沖洗后備用。

1.2 方法

1.2.1 內生細菌分離與培養(yǎng)

內生細菌分離采用組織塊分離法：在超凈工作臺上，先用大量的無菌水沖洗，再用75%乙醇擦拭，用無菌濾紙吸干表面殘留的液體；用無菌刀片將假鱗莖切成小塊，置于無菌研缽中，加入5 mL無菌水充分研磨，取500 μL研磨液于10 mL無菌離心管中，加入無菌水稀釋至3 mL，搖勻后備用。

內生細菌培養(yǎng)：用微量移液器吸取8 μL稀釋液，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上；將培養(yǎng)皿進行封口并做好標記；28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每隔12 h觀察1次并拍照記錄細菌生長情況。

1.2.2 內生細菌16S rDNA序列的PCR擴增

挑取內生細菌的單菌株，接種到LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫搖床中200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h后用作PCR模板。PCR引物采用細菌16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[14]。反應體系為：10 × PCR Buffer 2.0 μL，dNTPs 0.5 μL，27F和1492R引物各0.4 μL，菌液模板0.5 μL和TaqDNA聚合酶0.4 μL，最后加入適量ddH2O至總體積20 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共循環(huán)32次；72 ℃ 10 min。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。選取條帶亮度高且清晰的產物測序，引物合成與序列測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.3 革蘭氏陰、陽性鑒定

以安徽省巢湖市弘慈醫(yī)療器械有限公司生產的革蘭氏染色液為鑒定試劑，對內生細菌進行革蘭氏陰陽性鑒定[15-16]。具體步驟為：取潔凈載玻片數(shù)張，平放桌上，取一環(huán)需要鑒定的菌液涂布成1個直徑1.0～1.5 cm的圓形涂片，自然干燥；將Ⅰ液滴加在細菌涂片上，染色1 min后用蒸餾水洗去多余染料；滴加Ⅱ液，1 min后用蒸餾水洗去多余染料；滴加Ⅲ液脫色30 s，水洗；滴加Ⅳ液復染1 min，用蒸餾水洗去多余染料，自然干燥后鏡檢。若細菌呈藍紫色則為革蘭氏陽性菌，呈紅色則為陰性細菌[17]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)內生細菌16S rDNA測序結果，與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進行相似性比對分析，確定菌株的種屬[18]。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離培養(yǎng)

將內生細菌菌液均勻涂布到LB固體培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次細菌的生長情況。結果顯示，LB固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)的單菌落顏色、大小和生長速率均有差異；菌落光滑、凸起，且生長速度快。由雁蕩山采集的材料內生細菌生長迅速，菌落間存在顏色和生長速度的差異(圖1)。白巖山和劃巖山細葉石仙桃內生細菌觀察到類似的現(xiàn)象，也發(fā)現(xiàn)了大小不一的金黃色、淡黃色和白色的菌落。

A為0 h；B為24 h；C為48 h圖1 雁蕩山細葉石仙桃內生細菌的生長動態(tài)

2.2 內生細菌的革蘭氏染色

采用革蘭氏染色法對細葉石仙桃內生細菌進行鑒定，染色結果表明：所有供試材料分離得到的73個內生細菌革蘭氏染色結果均呈現(xiàn)紅色，表明從細葉石仙桃假鱗莖中分離得到的內生細菌都是革蘭氏陰性菌。同時在油鏡下對細菌形態(tài)特征進行觀察，發(fā)現(xiàn)雁蕩山1～20號內生細菌均呈長桿狀，初步鑒定1～20號菌為桿菌。經鏡檢，白巖山和劃巖山細葉石仙桃內生細菌也均為桿菌。

2.3 內生細菌16S rDNA序列的克隆

以內生細菌菌液為DNA模板，采用細菌16S rDNA通用引物27F和1492R進行PCR反應，產物進行凝膠電泳檢測。結果表明，所有內生細菌樣品均可擴增出大小約為1 500 bp的PCR產物(圖2)。電泳條帶單一、清晰且亮度大，可用于后續(xù)的測序實驗。

M為100 bp DNA標準分子量；1～10為內生細菌的PCR產物圖2 雁蕩山細葉石仙桃部分內生細菌16S rDNA的PCR擴增結果

2.4 內生細菌的序列分析

根據(jù)測序結果，利用Blast在線工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對來自雁蕩山、白巖山和劃巖山73個內生細菌的16S rDNA序列進行比對，以序列匹配度98%為最低指標確定種屬。結果表明：雁蕩山和白巖山細葉石仙桃中均分離得到9種內生細菌，劃巖山的樣品分離得到11種內生細菌。73個單菌株隸屬9個屬，分別為果膠桿菌屬(Pectobacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、科澤氏菌屬(Koserella)、藤黃色桿菌屬(Koserella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)(表1)。芽孢桿菌屬的種類最多，有3種，分別為巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和韋氏芽孢桿菌；類芽孢桿菌屬和假單胞菌屬次之，各為2種，分別是膠質類芽孢桿菌與多粘類芽孢桿菌、斯氏假單胞菌與棲稻假單胞菌。杓蘭果膠桿菌、產酸克雷伯菌、雷金斯堡預研菌、藤黃色桿菌、腸桿菌和斯氏假單胞菌在3個樣地采集到的細葉石仙桃內均有分布。

表1 不同地理來源的細葉石仙桃內生細菌的 種類分布

注：+ 表示有，-表示無。

3 討論

目前，在各種植物中發(fā)現(xiàn)的內生細菌已超過54個屬120多種[19]。朱育菁等[20]在無患子科(Sapindaceae)龍眼(Dimocarpuslongan)果實內分離到腸桿菌屬、果膠桿菌屬、克魯沃菌屬(Kluyvera)和沙門氏桿菌屬(Salmonella)等內生菌。內生細菌中，大多數(shù)內生細菌為土壤微生物種類，其中假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬以及土壤桿菌屬(Agrobacterium)最為常見[19]。本實驗從細葉石仙桃體內分離得到假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、果膠桿菌屬、產酸克雷伯菌和成團泛菌等多種細菌種屬。假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬還有伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)等是多種林木植物的解磷細菌[21-23]。杓蘭果膠桿菌也是一種解磷細菌，可通過自身的代謝活動將土壤基質中難溶的磷元素轉化為可溶性磷，利于植物吸收從而提高產量[24]。王舒等[25]從油茶(Camelliaoleifera)中分離到杓蘭果膠桿菌等3種細菌，對其解磷能力進行試驗，結果顯示，篩選得到菌株的解磷能力都較高，可有效提高油茶對磷的利用率。

生物固氮可為農業(yè)提供經濟價值高、對環(huán)境無污染的氮肥，是生物學領域的一項重要研究課題[26]?？死撞暇鷮偈且活惞痰矢锾m氏陰性[27]，本實驗結果與此一致。李宏偉等[28]和朱俊波[29]對克雷伯氏菌進行研究發(fā)現(xiàn)，其SW1菌株具有較高的固氮酶活性，HP1菌株具有較高產氫活力，通常用于制備氫燃料。陳卓君等[30]以白菜(Brassicapekinensis)、油菜(B.campestris)和玉米(Zeamays)作為研究材料，發(fā)現(xiàn)產酸克雷伯菌可通過固氮和產生生長素促進植物生長。馮永君[31]初步發(fā)現(xiàn)成團泛菌YS19可利用光合作用固定的有機碳源和能量進行代謝來固定大氣中的游離氮氣，促使植物更好生長。本研究中，在3個樣點的細葉石仙桃中均分離到產酸克雷伯氏菌，它是否具有固氮作用，尚待進一步研究。

假單孢菌屬細菌在植物病害的生物防治上有著廣泛應用。研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌能在代謝反應中產生多種抗菌產物，可有效抵御病原細菌、真菌和線蟲等微生物，部分產物還具殺蟲功能，可替代農藥試劑，提升植物的抗病能力，在保護生態(tài)環(huán)境方面也有潛在價值[32-34]。朱玥妍等[35]對芽孢桿菌屬的多種菌進行研究分析，提出芽孢桿菌可作為生防菌劑，其中，地衣芽孢桿菌(B.lincheniformis)對番茄(Lycopersiconesculentum)、棉花(Ginkgobiloba)和辣椒(Capsicumannuum)等多種植物的病害有防治功能，如番茄灰霉病和棉花枯萎病等[36-37]。韋氏芽孢桿菌在生物防治方面也有較好的前景，對馬鈴薯(Solanumtuberosum)壞疽病、枯萎病和炭疽病等也均具防治效果，而且還有溶磷和固氮作用[38]。張淑梅等[39]從番茄葉片中分離篩選到具廣譜抑真菌活性的類芽孢桿菌，其對水稻(Oryzasativa)惡苗病菌有明顯的拮抗抑制作用。本研究中，分離到膠質類芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和韋氏芽孢桿菌等芽孢桿菌，膠質類芽孢桿菌為雁蕩山細葉石仙桃所特有，韋氏芽孢桿菌為劃巖山樣品所特有，今后將進一步研究它們的功能。

研究表明，植物內生細菌易在細胞或組織的間隙形成聚集群落，便于吸收營養(yǎng)物質，也避免環(huán)境威脅，保證了生存環(huán)境的適宜性[10]。內生細菌可作為聯(lián)合固氮菌劑，對植物固氮起到積極作用，可分泌產生多種對植物有促生作用的激素，也可用作載體將外源基因轉入宿主細胞[40-41]。許多內生細菌在非豆科植物固氮方面的作用十分顯著，在溶磷和抗蟲抗病等方面也有較大作用，在環(huán)境保護和農業(yè)生產中更是具有潛在的應用價值[42-43]。本實驗對細葉石仙桃內生細菌進行分離與鑒定，得到果膠桿菌屬、克雷伯氏菌屬、泛菌屬和芽孢桿菌屬等多種屬種，為進一步研究生物固氮、防治以及溶磷作用提供物質基礎和理論支持，為進一步探索內生細菌的生物學功能和生理提供一定的基礎材料。

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