朱 靖 博， 王 鑫， 丁 燕

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

海洋魚油中含有豐富活性成分，其中，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)具有舒張血管、抑制血小板凝集及預(yù)治老年癡呆等多種生理活性及保健功能[1-3]，已成為近年來保健食品和藥品研發(fā)的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的EPA與 DHA分離純化方法包括尿素包合法[4]、有機(jī)溶劑萃取法[5]等，存在溶劑消耗多、產(chǎn)品純度差等問題，無法進(jìn)行有效富集分離。

隨著超臨界技術(shù)的興起與日漸發(fā)展，國內(nèi)外對(duì)于利用超臨界CO2技術(shù)提純魚油中EPA和DHA的研究報(bào)道已屢見不鮮，劉偉民等[6]利用連續(xù)精餾濃縮及正交試驗(yàn)的方法進(jìn)行分離純化，得到二者混合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83%，回收率為84%。FIORI等[7]通過調(diào)整壓力、溫度等參數(shù)，進(jìn)行C20和C22組分有效分離，純度達(dá)到85%。本實(shí)驗(yàn)在已有研究基礎(chǔ)上，將超臨界流體萃取、精餾及色譜技術(shù)有效結(jié)合，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。尋求更有效提純EPA-EE和DHA-EE的方法，探索最優(yōu)工藝。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原料與試劑

純度為92%的EPA和純度為88%的DHA標(biāo)準(zhǔn)品，仁普蘇州藥業(yè)有限公司；純度為18%的EPA-EE和純度為12%的DHA-EE，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；CO2，大連富洋氣體有限公司；氮?dú)猓筮B大特氣體有限公司；正己烷，色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超臨界流體萃取-色譜設(shè)備(自制)；GC7890F氣相色譜儀，上海天美科學(xué)儀器有限公司；P270高壓恒流泵，大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 超臨界CO2萃取條件

超臨界流體萃取-色譜一體裝備的原理流程圖如圖1所示。精餾塔高度2.8 m，內(nèi)徑3 mm，系統(tǒng)耐壓30 MPa，包括七段控溫塔，溫度由下至上梯度升高，原料進(jìn)料口包括上中下三處，CO2在塔底進(jìn)入，攜帶樣品依次進(jìn)入上一級(jí)精餾塔。

設(shè)備工作時(shí)，首先設(shè)置萃取塔的溫度梯度；待溫度顯示值穩(wěn)定后打開冷井，接通CO2，體積流量可通過控制CO2泵頭的轉(zhuǎn)速控制；持續(xù)通入CO2控制壓力；待壓力穩(wěn)定后，通過高壓恒流泵控制進(jìn)料量，注入魚油乙酯樣品；超臨界CO2攜帶樣品進(jìn)入精餾塔，輕組分先從柱頂出來，通過管路，進(jìn)入分離器，而重組分因?yàn)槿芙舛刃×粼谒?nèi)，待減壓后得到分離器和塔底餾分；餾分中所得EPA-EE 和DHA-EE的含量用氣相色譜測定。

圖1 超臨界流體萃取-色譜設(shè)備結(jié)構(gòu)

1.2.2 超臨界色譜條件

萃取罐填料為300～400目硅膠，干法上樣，同時(shí)在萃取罐下方抽真空使填料裝填緊密；將萃取塔底的油樣泵入萃取罐底部，上樣量10 mL，以超臨界CO2為流動(dòng)相，進(jìn)一步分離提純EPA-EE和DHA-EE。整個(gè)色譜分離過程分為兩段，截取第一段用于除掉EPA-EE和DHA-EE之前的脂肪酸乙酯；截取第二段主要是實(shí)驗(yàn)所需的經(jīng)提純的EPA-EE和DHA-EE，用氣相色譜檢測。

1.2.3 氣相色譜儀分析

色譜柱為SE-54毛細(xì)管柱，涂布厚度0.5 μm，內(nèi)徑0.32 mm，柱長30 m。操作溫度：柱溫230 ℃，進(jìn)樣口溫度280 ℃，檢測器(FID)溫度280 ℃；升溫程序：初始溫度230 ℃，持續(xù)2 min，以10 ℃/min升溫至250 ℃并持續(xù)10 min；氣體體積流量由壓力控制，載氣(N2)壓力0.5 MPa，燃?xì)?H2)體積流量30 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 進(jìn)樣口的選擇

在萃取溫度梯度40～90 ℃、萃取壓力14 MPa、CO2體積流量100 mL/min、樣品進(jìn)樣速率2 mL/min、總進(jìn)樣量200 mL條件下，對(duì)精餾柱上、中、下3個(gè)進(jìn)料端口分別進(jìn)料，樣品經(jīng)超臨界CO2萃取，EPA-EE和DHA-EE萃取產(chǎn)物在塔底富集。萃取過程中，輕組分隨超臨界CO2進(jìn)入分離器，分離比率越高，EPA-EE和DHA-EE的回收率越低，控制其進(jìn)入分離器的量將有效提高產(chǎn)物得率。結(jié)果如表1所示，通過分離器接收量、塔底接出量及產(chǎn)物得率結(jié)果比較確定，下端進(jìn)料口為最佳進(jìn)量端口。

表1 不同進(jìn)料端口對(duì)魚油提取效果的影響

2.2 溫度梯度

以塔底EPA-EE和DHA-EE總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考核指標(biāo)，如表2所示，隨著塔頂溫度的增加(即溫度梯度的增大)，塔底組分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷增加。以萃取壓力14 MPa、CO2體積流量100 mL/min和樣品進(jìn)樣速率2 mL/min為條件，經(jīng)系列參數(shù)比對(duì)，確定塔頂溫度為90 ℃。以EPA-EE和DHA-EE回收率為考核指標(biāo)，結(jié)果如表2所示。溫度梯度對(duì)產(chǎn)品回收率具有線性影響，隨著頂端溫度的升高，兩者的回收率都隨之升高，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃，回收率分別達(dá)到58.6%和84.9%；當(dāng)溫度升高到90 ℃時(shí)，回收率分別達(dá)到60%和90%，亦表明，超臨界CO2的溶解性隨溫度的降低而增強(qiáng)，使得EPA-EE和DHA-EE被攜帶進(jìn)入分離器中的可能增大。

表2 溫度梯度對(duì)魚油提取效果的影響

2.3 壓 力

萃取壓力高低決定了超臨界CO2的密度以及樣品分子間的傳質(zhì)效率，最終影響樣品的溶解效果[8]。

壓力對(duì)萃取過程的影響如表3所示，塔底EPA-EE和DHA-EE的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨壓力的增大而先增加后減少。產(chǎn)品回收率結(jié)果顯示，回收率隨著壓力的增大逐漸降低，當(dāng)壓力降低到15 MPa時(shí)，回收率降低到77.0%和56.4%。此外，在溫度梯度40～90 ℃、CO2體積流量100 mL/min、魚油進(jìn)樣速率2 mL/min的條件下，綜合考慮選擇萃取最佳壓力為14 MPa，此結(jié)果與Maschietti等[9]的規(guī)律相符合。

表3 壓力對(duì)魚油提取效果的影響

2.4 CO2體積流量

由表4可知，在溫度梯度40～90 ℃、萃取壓力14 MPa、魚油進(jìn)樣速度2 mL/min的條件下，CO2體積流量在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)增高，塔底EPA-EE和DHA-EE的含量也變高，所以選擇CO2的最佳體積流量為100 mL/min。CO2體積流量對(duì)回收率有一定影響但并不顯著，該結(jié)果與Perretti等[10]對(duì)CO2體積流量條件的考查結(jié)果相符合。

表4 CO2體積流量對(duì)魚油提取效果的影響

2.5 色譜分離的時(shí)間分段

在超臨界流體色譜分離過程中，關(guān)鍵步驟是對(duì)餾出物進(jìn)行有效分段，使魚油乙酯中其他脂肪酸乙酯雜質(zhì)盡量在第一段餾出物中，即20 min之前接出的分離器中的餾出物沒有EPA-EE和DHA-EE；在第二段(20～30 min)接出的餾出物中，只含有少量EPA-EE，不含有DHA-EE。氣相色譜檢測結(jié)果表明，第二段餾分中EPA-EE質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47.12%，第三段餾分中DHA-EE質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.89%，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)是87.01%，提純前后氣相色譜對(duì)比見圖2。

(a) 提純前

(b) 提純后

圖2 提純前后魚油樣品的氣相色譜鑒定結(jié)果

Fig.2 Gas chromatograms of the oil fish samples before and after purified

3 結(jié) 論

通過對(duì)超臨界流體萃取和色譜相結(jié)合的一體化分離裝備分離過程中的萃取溫度梯度、萃取壓力、CO2體積流量、色譜參數(shù)等條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，得到魚油中EPA和DHA的最佳分離純化工藝：進(jìn)料口為最下端，萃取壓力14 MPa，萃取溫度梯度40～90 ℃，魚油進(jìn)樣速率2 mL/min，超臨界CO2體積流量100 mL/min，色譜柱填料為300～400目硅膠，色譜分離壓力14 MPa，色譜分離溫度40 ℃。在此條件下，產(chǎn)品中EPA-EE和DHA-EE的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可由原料中的30%提升到87%。

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