劉 馨 月, 張 公 亮, 王 佳 瑩, 劉 麗, 侯 紅 漫

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

鮑魚含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，口感獨特，有很高的食用價值。但是，鮑魚在食用和使用過程中極易發(fā)生腐敗變質(zhì)，失去特有的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)[1]。Dalgaard[2]研究認為，在多數(shù)情況下，部分微生物參與食品的腐敗過程。水產(chǎn)品加工過程中，環(huán)境溫度一般控制在0～15 ℃或更高，在夏季由于天氣的原因溫度較高，水產(chǎn)品更容易腐敗變質(zhì)，了解鮑魚在4和20 ℃貯藏過程中細菌的種類，進而有針對性地采取相應(yīng)措施，以提高鮑魚的食用價值。因此了解鮑魚貯藏過程中的細菌多樣性十分必要。對于水產(chǎn)品中細菌多樣性的研究多采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法，再根據(jù)各種的表型觀察鑒定，但由于某些表型不是特有表型，會導(dǎo)致鑒定錯誤[3]；有些細菌目前還不能被人為培養(yǎng)，從而導(dǎo)致多樣性分析不夠全面準確。目前，出現(xiàn)了許多分子生物學(xué)的方法，能快速而準確的檢測微生物，包括變性梯度凝膠電泳、454焦磷酸測序和限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)等[4]。

本實驗采用PCR-RFLP方法研究鮑魚在冷藏(4 ℃)和常溫(20 ℃)貯藏過程中細菌菌群的多樣性，以期更加全面準確地了解鮑魚在貯藏過程中細菌的種類及變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

PCR擴增儀，美國伯樂公司；JM-250電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司；凝膠成像儀，美國伯樂公司；MicroOne掌上離心機，日本TOMY公司。

1.2 主要試劑

DNeasy blood & tissue kit，德國Qiagen；LA Taq酶，Ex Taq Version 2.0，pMD19-T載體，大腸桿菌JM109，HaeⅢ、HinfⅠ，寶生物大連有限公司；1 492r、27f、RV-M、M13、IPTG、X-Gal，生工生物(上海)有限公司。

1.3 樣品及前處理

2016年7月于大連長興市場購買新鮮皺紋盤鮑，活體運回實驗室。去殼去內(nèi)臟，用無菌袋包裝置于4和20 ℃貯藏。每個取樣點取3個平行，每個溫度取4個時間點。4 ℃時間點為0、6、12、18 d，20 ℃時間點為0、24、48、72 h。

1.4 鮑魚中細菌總DNA提取和PCR擴增

取鮑魚肉15 g，轉(zhuǎn)移到45 mL已滅菌的1×PBS中，300 r/min振蕩10 min，使細菌充分洗脫，在4 ℃下800 r/min離心10 min，取上清；上清液7 000 r/min離心10 min后，收集菌體沉淀，于-80 ℃保存以備提取細菌總DNA。

將菌體沉淀參照說明書進行后續(xù)操作。結(jié)果在1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測。將提取的DNA進行混合，并放置在-20 ℃下保存，備用。

PCR選擇細菌的通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492r(5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行擴增，片段長度約為1 500 bp[5]。反應(yīng)擴增體系為50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物切膠，經(jīng)試劑盒回收。

1.5 藍白斑篩選陽性克隆子

1.5.1 連接、轉(zhuǎn)化及陽性克隆子的篩選

回收后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T過夜連接，再轉(zhuǎn)入E.coli感受態(tài)細胞JM109中，轉(zhuǎn)化后的細胞37 ℃下培養(yǎng)12～16 h，進行藍白班篩選轉(zhuǎn)化子。挑取陽性克隆子，采用載體通用引物RV-M和M13-47重新擴增插入片段，1%瓊脂糖電泳檢測，將正確的克隆子進行二次PCR擴增。

1.5.2 限制性片段多態(tài)性分析和測序

經(jīng)過PCR擴增后得到的不同的16S rDNA片段，采用限制性內(nèi)切酶HinfⅠ和HaeⅢ[6]在37 ℃進行特異性酶切3 h。將具有不同酶切譜型的二次PCR產(chǎn)物送交至生工生物有限公司進行測序。

1.6 結(jié)果分析

測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站的BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行相似性比較分析，鑒定細菌種類。對鑒定后的菌種通過MAGE6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 鮑魚中細菌總DNA的提取及PCR擴增

從鮑魚中獲得的可直接進行PCR擴增的細菌總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和酶標儀檢測，DNA的OD 260/280均在1.7～1.9，符合DNA純度要求。并以提取的DNA為模板，采用細菌通用引物(27f和1 492r)進行PCR擴增，得到的目的片段長度1 500 bp，結(jié)果如圖1所示。其結(jié)果與細菌通用引物的大小相同，為實驗所需片段，對PCR產(chǎn)物進行切膠回收。

M，2 000 bp的DNA marker；1～7，PCR產(chǎn)物

2.2 藍白班篩選陽性克隆子

2.2.1 連接、轉(zhuǎn)化及陽性克隆子的篩選

將切膠回收后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T以質(zhì)量比10∶1混合過夜連接，導(dǎo)入E.coli感受態(tài)細胞JM109中，37 ℃培養(yǎng)14 h。在4 ℃顯色3 h。隨機挑取200個白斑進行菌落PCR，產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.2.2 限制性片段多態(tài)性分析和測序

以挑取的陽性克隆子為模板，細菌的通用引物(27f和1 492r)進行二次PCR擴增，擴增后的產(chǎn)物用HinfⅠ和HeaⅢ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物見圖2。根據(jù)酶切位點的不同，將PCR產(chǎn)物切成片段大小不同的條帶，得到不同酶切條帶如表1所示。

M，100 bp的DNA marker；1～24，酶切產(chǎn)物

表1 PCR產(chǎn)物的不同酶切圖譜個數(shù)

經(jīng)過限制性片段多態(tài)分析后得到不同的酶切圖譜，將其二次克隆的PCR產(chǎn)物送至生工生物測序，測序后得到的序列在與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列進行比對，結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計分析后得到鮑魚貯藏過程中細菌種類及種屬個數(shù)的分布，如表2所示。

表2 鮑魚在4和20 ℃貯藏過程中細菌的種類、菌株數(shù)量及其分布

通過Blast中的序列比對和對細菌種類的歸類分析，發(fā)現(xiàn)鮑魚貯藏過程中共有6個系統(tǒng)類群，為變形桿菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicute)和未分類的細菌(Unclassified)。其中變形桿菌門為鮑魚主要菌群組成成分，在貯藏初期尤為明顯，這一結(jié)果與國內(nèi)外產(chǎn)品中微生物多樣性的研究結(jié)果相類似。比對后得到20種(屬)細菌，分別為嗜冷單胞菌屬、弓形桿菌、弧菌、發(fā)光桿菌、乳球菌、黃桿菌和梭形桿菌屬等。在貯藏過程中，弧菌和弓形桿菌的種類有先增加后減少的變化趨勢。在貯藏末期，依據(jù)細菌的種類占總細菌種類比例的多少，得到鮑魚在貯藏末期時的優(yōu)勢菌。在20 ℃ 貯藏72 h 的優(yōu)勢菌為乳酸乳球菌(30%)，4 ℃ 貯藏18 d 的優(yōu)勢菌為梭桿菌(29%)。

由表2可知，貯藏初期新鮮的鮑魚中細菌組成成分復(fù)雜，隨著時間的增加，細菌組成成分變得單一。初始點細菌種類較多，主要與其生活環(huán)境及捕撈時的季節(jié)和衛(wèi)生狀況等多種因素相關(guān)[7]。在4和20 ℃貯藏過程中，變形桿菌門均有存在，其中的弧菌和弓形桿菌均出現(xiàn)明顯地增加，到貯藏后期又降低，弧菌在20 ℃貯藏后期消失。曹榮[8]對太平洋牡蠣的研究中加入自制保鮮劑后其貯藏后期的優(yōu)勢菌群為乳球菌，本實驗20 ℃貯藏后期的優(yōu)勢菌群也為乳球菌。

圖3 4和20 ℃貯藏過程中鮑魚細菌的多樣性及分布

根據(jù)測序得到的序列構(gòu)建部分菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示。兩個系統(tǒng)發(fā)育樹均為兩大同源關(guān)系分支，其中Ahrensiakielensis和Psychromonassp.、Vibrio和Arcobacter、Ilyobacter和Fusobacterium同源關(guān)系較近。

羅慶華[9]研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)品在有氧冷藏中，貯藏后期細菌多為假單胞菌或腐敗希瓦氏菌，在本研究中未鑒定出這兩種細菌，可能的原因是產(chǎn)品的種類、棲息水域、捕獲方式、季節(jié)或貯藏條件及方式等的差異導(dǎo)致。

3 結(jié) 論

鮑魚在冷藏(4 ℃)和常溫(20 ℃)貯藏過中，細菌的多樣性整體呈下降趨勢。貯藏初期樣品中優(yōu)勢類群為變形桿菌門和未分類的細菌。貯藏中期弧菌和弓形桿菌有明顯的增加。4 ℃貯藏18 d的優(yōu)勢系統(tǒng)類群為梭桿菌門；20 ℃貯藏7 h時，厚壁菌門為優(yōu)勢系統(tǒng)類群，優(yōu)勢菌分別為梭桿菌和乳酸乳球菌。通過RFLP方法研究鮑魚的細菌菌群多樣性，避免了傳統(tǒng)方法中不可培養(yǎng)的細菌引起的誤差，還可以通過對測序結(jié)果的分析，判定其同源關(guān)系的遠近，以便更好地利用鮑魚及其相關(guān)產(chǎn)品。

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(a) 20 ℃

(b) 4 ℃

圖4 鮑魚兩種貯藏條件下的細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.4 Phylogenetic trees of bacteria in abalone at two kinds of storage conditions

[7] 沈萍,李學(xué)英.低溫貯藏過程中魷魚細菌組成的變化及優(yōu)勢腐敗菌鑒定[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(6):236-242.

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[9] 羅慶華.水產(chǎn)品特定腐敗菌研究進展[J].食品科學(xué),2010,31(23):468-472.