白音扎布，白長喜

人參作為藥中之王，是常用的一味名貴中藥材。人參皂苷Rg1在人參或三七根莖中含量較為豐富，對人體具有廣泛的藥理活性[1]。Rg1經(jīng)化學(xué)降解或經(jīng)腸道菌群代謝后，可得到人參皂苷Rh1[2]。在糖脂代謝方面，Rg1具有降低血糖、抑制脂肪細(xì)胞分化等作用[3]，但對于Rh1是否具調(diào)節(jié)糖脂代謝作用卻研究甚少。本研究以Rh1與Rg1干預(yù)3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞（簡稱3T3-L1細(xì)胞）的增殖與分化，比較兩者對細(xì)胞功能的影響，并探討其初步機(jī)制，為進(jìn)一步研究人參皂苷Rh1調(diào)節(jié)糖脂代謝作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied BiosysStems），酶標(biāo)檢測儀（北京普朗）；3T3-L1細(xì)胞系購自ATCC細(xì)胞庫；人參皂苷Rg1、Rh1（純度均大于98%，購于成都普思生物）；細(xì)胞培養(yǎng)所需培養(yǎng)基均購自Hylone，血清均購自GIBCO公司；噻唑藍(lán)（MTT）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）等誘導(dǎo)劑購自Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒購自于Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT比色法分析Rh1和Rg1對3T3-L1細(xì)胞增殖的影響在恒溫37℃、5%CO2條件下，3T3-L1細(xì)胞以含10%的NCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代接種于96孔板中，調(diào)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)至4000～5000個(gè)/孔，每孔加入120 μl的含藥或空白培養(yǎng)基孵育細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)藥物組（分別含Rh1 25、50、100 μmol/L）、對照組（分別含Rg1 25、50、100 μmol/L）及空白組（藥物濃度0 μmol/L），每組藥物設(shè)6個(gè)平行對照孔，另設(shè)調(diào)零孔。分別在藥物孵育細(xì)胞24、48、72 h后，加入噻唑藍(lán)，繼續(xù)孵育2 h，加入DMSO振搖，MTT比色法檢測各孔光密度值（OD）值。

1.2.2 油紅染色測定Rh1和Rg1對3T3-L1細(xì)胞分化的影響以含10%FBS的DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，將處于對數(shù)生長期的3T3-L1細(xì)胞接種于96孔板中，移液器換液至細(xì)胞單層生長鋪滿孔底。繼續(xù)接觸抑制2 d后，采用雞尾酒法開始誘導(dǎo)分化，直至細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。在誘導(dǎo)分化的開始，即加入不同濃度的藥物（同上）孵育細(xì)胞，并設(shè)置相應(yīng)濃度的對照組及空白組。在細(xì)胞分化的第8 d(細(xì)胞已分化成熟)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行油紅O染色分析。

1.2.3 RT-PCR測定Rh1和Rg1對細(xì)胞PPARγ和脂聯(lián)素基因表達(dá)的影響細(xì)胞藥物處理同前，并設(shè)空白組。在細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟后（第8 d），收取細(xì)胞，Trizol法提取成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)總RNA，將RNA稀釋至1 μg/μl，配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，合成cDNA第一鏈。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配置反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)引物序列是：Adiponectin上游：5'-GTTGCAACCTCTCCTGTTGC-3'，下游：5'-TCTCCAG GAGTGCCATCTCT-3'；PPARγ上游：5'-GGAAGACC ACTCGCATTCCTT-3'，下游：5'-GTAATCAGCAACCA TTGGGTCA-3'；β-actin上游：5'-TGCCGAAGATGACG TTACTACAA-3'，下游：5'-CCCCGTGGCCCTTCAGCT C-3'。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像并計(jì)算PPARγ以及脂聯(lián)素mRNA相對于空白組的相對表達(dá)量。

1.2.4 Western blot法測定Rh1和Rg1對細(xì)胞PPARγ和脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的影響如前處理細(xì)胞，并設(shè)空白組。細(xì)胞分化成熟后（第8 d），取裂解細(xì)胞低溫離心，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定樣品蛋白含量。將細(xì)胞樣品蛋白加入電泳槽內(nèi)電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后，PVDF膜在稀釋的一抗孵育液中緩慢搖動(dòng)過夜。次日浸沒于二抗孵育液中，室溫孵育1 h后化學(xué)發(fā)光。Western blot測定結(jié)果用Quantity One軟件分析，結(jié)果用PPARγ蛋白或脂聯(lián)素蛋白與β-actin的灰度值之比表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rh1和Rg1對3T3-L1細(xì)胞增殖影響與空白組相比，50和100 μmol/L的Rh1和Rg1均對3T3-L1細(xì)胞有顯著的促增殖作用。而Rh1與Rg1相比，中高濃度下，Rh1對細(xì)胞的促增殖作用更顯著（P＜0.05，表1）。

2.2 人參皂苷Rh1和Rg1對3T3-L1細(xì)胞分化的影響3T3-L1細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞過程中，細(xì)胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)闄E圓形，并內(nèi)含脂肪滴。誘導(dǎo)8 d后收取細(xì)胞進(jìn)行油紅染色，可見戒環(huán)狀紅色圓點(diǎn)（圖1）。與空白組比較，50和100 μmol/L的Rh1和Rg1均顯著抑制3T3-L1細(xì)胞的脂肪聚集；與Rg1比較，Rh1的抑制作用更強(qiáng)（P＜0.05）。

2.3 人參皂苷Rh1和Rg1對3T3-L1細(xì)胞PPARγ和脂聯(lián)素基因表達(dá)的影響灰度分析結(jié)果Rh1和Rg1干預(yù)細(xì)胞誘導(dǎo)分化8 d后，均抑制PPARγ mRNA的表達(dá)，而上調(diào)脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)。與Rg1相比，在50、100 μmol/L濃度下，Rh1對PPARγ的mRNA表達(dá)的抑制作用更明顯（P＜0.05），分別下調(diào)32.48%、58.67%；Rh1對脂聯(lián)素mRNA表達(dá)促進(jìn)作用更明顯（P＜0.05），分別上調(diào)49.08%、106.01%。見表2。

表1 人參皂苷Rh1和Rg1對3T3-L1細(xì)胞增殖的影響

圖1 人參皂苷Rh1和Rg1對3T3-L1細(xì)胞成脂分化的影響

表2 Rh1和Rg1對3T3-L1細(xì)胞基因表達(dá)的影響（n=6）

2.4 人參皂苷Rh1和Rg1對3T3-L1細(xì)胞PPARγ和脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果，人參皂苷Rh1和Rg1在50、100 μmol/L濃度下，均顯著抑制PPARγ的蛋白表達(dá)，而增加細(xì)胞內(nèi)脂聯(lián)素的蛋白表達(dá)，且Rh1作用均強(qiáng)于Rg1（P＜0.05）。見表3。

表3 Rh1和Rg1對3T3-L1細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響(n=6）

3 討論

脂肪組織與人類肥胖、Ⅱ型糖尿病等多種疾病的發(fā)生息息相關(guān)，有研究表明，脂肪細(xì)胞過度肥大是導(dǎo)致脂肪組織代謝異常的主要原因[4]。3T3-L1細(xì)胞在形態(tài)變化、脂質(zhì)聚集以及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)等方面都能充分展示脂肪組織的特點(diǎn)。因此，成為國際上公認(rèn)的研究糖脂代謝的模型細(xì)胞[5]。研究表明，PPARγ在高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化、Ⅱ型糖尿病、肥胖癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中，起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[6]。目前，普遍認(rèn)為人參皂苷Rg1具有調(diào)節(jié)糖脂代謝作用，但其作用機(jī)制不甚明確，Koh等[7]認(rèn)為Rg1能抑制PPARγ、C/EBPs等轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)，并且增加活性氧簇的表達(dá)，從而影響3T3-L1細(xì)胞脂肪聚集。Sung等[8]研究表明，人參皂苷Rg1通過AMPK的激活，抑制肝癌細(xì)胞中葡萄糖的產(chǎn)生。而Rh1作為Rg1的主要代謝產(chǎn)物，是否具有調(diào)節(jié)糖脂代謝的藥理活性，其作用機(jī)制與Rg1是否相同，成為本實(shí)驗(yàn)關(guān)注的焦點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，Rh1作為Rg1的代謝產(chǎn)物，在中高濃度時(shí)，更能促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的增殖。Kim等[9]研究表明，Rg1在高濃度時(shí)，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用（抑制細(xì)胞增殖）；而Rh1在高濃度時(shí)，仍然促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示其生物毒性更小。Rh1和Rh1對PPARγ的基因與蛋白的表達(dá)均呈現(xiàn)出下調(diào)作用，且Rh1在中高濃度下作用更強(qiáng)。這與其抑制細(xì)胞分化的作用相一致，本研究可以推測，Rh1可通過下調(diào)PPARγ的基因表達(dá)，減少PPARγ所介導(dǎo)的脂肪聚集，對改善由于PPARγ受體過度上調(diào)和激活帶來的體重增加有一定作用。

人參皂苷Rh1對3T3-L1細(xì)胞的促增殖作用以及抑制分化作用都強(qiáng)于Rg1，且Rh1能顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PPARγ基因和蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)脂聯(lián)素基因和蛋白的表達(dá)，推測Rh1可能改善糖脂代謝紊亂，有待進(jìn)一步深入研究。

[1]尚文斌,楊穎,陳名道.人參及其主要成分抗糖尿病作用機(jī)制[J].國際內(nèi)分泌代謝雜志,2007,27(2):115-117.

[2]陳聲武,王巖,王毅,等.人參皂苷Rg1和Rh1抗腫瘤作用的研究[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2003,29(1):25-28.

[3]蓋鑫,弓曉杰,魯明明,等.人參治療糖尿病有效成分研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,29(3):539-540.

[4]劉菲,舒麗,胡湘南,等.吡格列酮衍生物CQMUHS-03對3T3-L1細(xì)胞增殖分化的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2014,30(1):66-71.

[5]Poulos SP,Dodson MV,Hausman GJ.Cell line models for differentiation:preadipocytes and adipocytes[J].Experimental Biology and Medicine,2010,235(10):1185-1193.

[6]Robinson E,Grieve DJ.Significance of peroxisome proliferator-activated receptors in the cardiovascular system in health and disease[J].Pharmacol Ther,2009,122(3):246-263.

[7]Koh EJ,Hui JJ,Min JS,et al.Panaxsaponin Rg1 inhibits lipid accumulation and ROS production in 3T3-L1 cellsduring adipogenesis[M].2014 International Symposium and Annual Meeting,2014(10):345.

[8]Sung Jip Kim,Hai Dan Yuan,Sung Hyun Chung.Panaxsaponin Rg1 suppresses hepatic glucose production via AMP-Activated protein ki-nase in hepG2 cells[J].Biological&Pharmaceutical Bulletin,2010,33(2):325.

[9]Kim KJ,Koh EJ,Jia C,et al.Panaxsaponin Rg1 suppresses early stageofadipocytedevelopmentviaactivationofC/EBP homologous protein-10 in 3T3-L1 and attenuates fat accumulation in high fat diet-induced obese zebrafish[J].Journal of Ginseng Research,2015,39(5):15.