程 艷，陳 璐，米艷華*，段紅平，茶應(yīng)盛，邵金良，杜麗娟

植物在正常的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定量的活性氧（ROS），主要有 O－2·、H2O2、·OH、·O2等［1］。在重金屬脅迫下植物體內(nèi)的 ROS會(huì)大量增加，導(dǎo)致植物內(nèi)發(fā)生代謝紊亂［2］。植物通過(guò)不斷地提高各種抗氧化酶的活性來(lái)消除活性氧產(chǎn)生的不利影響，保障植物正常的生長(zhǎng)［3－5］。因此對(duì)植物過(guò)氧化酶活性的研究，可以掌握植物應(yīng)對(duì)土壤重金屬毒害的解毒應(yīng)激機(jī)理，為進(jìn)一步研究如何防控土壤重金屬對(duì)植物的危害提供理論依據(jù)。

在抗氧化酶系統(tǒng)中超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）是兩個(gè)非常重要的檢測(cè)指標(biāo)。SOD的測(cè)定方法分為直接法和間接法，由于直接法所需的儀器設(shè)備價(jià)格昂貴以及SOD基質(zhì)－O2－的不穩(wěn)定性，一般多數(shù)采用間接法［6］。間接法分為鄰苯三酚自氧化法、細(xì)胞色素C還原法、氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法、黃嘌呤氧化酶－NBT 法等多種方法［7－9］。 POD 的檢測(cè)方法有碘量滴定法［10］、氧電極法和比色法等方法；碘量滴定法重現(xiàn)性差，誤差大［11］；氧電極法需要特殊的儀器——氧電極儀，且需要標(biāo)準(zhǔn)酶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作較繁雜。過(guò)氧化氫酶（CAT）的檢測(cè)是根據(jù)CAT催化H2O2生成O2和H20來(lái)測(cè)定其活性，測(cè)定方法有滴定法、紫外分光光度法和氧電極法［12］。

目前在國(guó)內(nèi)外的研究中，測(cè)定抗氧化酶活性的方法較多，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有統(tǒng)一的檢測(cè)方法。由于不同檢測(cè)方法的反應(yīng)原理和酶活力單位定義不同，靈敏度和差異性較大，檢測(cè)結(jié)果差異也較大。在SOD的測(cè)定方法中，鄰苯三酚法的測(cè)定結(jié)果受pH值與鄰苯三酚濃度的影響顯著，因此用該方法測(cè)定SOD時(shí)必須嚴(yán)格控制pH，準(zhǔn)確配制規(guī)定濃度的鄰苯三酚溶液，且在進(jìn)行測(cè)定時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)酶液對(duì)鄰苯三酚自氧化速度的負(fù)抑制現(xiàn)象［13］；細(xì)胞色素C還原法被認(rèn)為是間接法中的經(jīng)典方法，但要求高純度的細(xì)胞色素C和黃嘌呤氧化酶；而NTB還原法沒(méi)有這些要求，靈敏度比前者約高14.7倍，已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究［14－16］。 在 POD 的測(cè)定中，愈創(chuàng)木酚法是應(yīng)用最廣泛的方法，其價(jià)格較經(jīng)濟(jì)，且無(wú)需特殊的儀器。在CAT的測(cè)定中，滴定法誤差較大；氧電極法需要專門(mén)的儀器，且CAT標(biāo)準(zhǔn)酶樣品受溫度的影響較大；紫外分光光度法是最常用的方法。

本文以水稻為研究對(duì)象，利用酶檢測(cè)試劑盒與傳統(tǒng)檢測(cè)方法對(duì)水稻根部抗氧化酶的活性進(jìn)行了檢測(cè)，以便篩選出一種便捷、結(jié)果可信度高的檢測(cè)方法，為后續(xù)檢驗(yàn)測(cè)定水稻不同部位的抗氧化酶活性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

水稻盆栽試驗(yàn)在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研基地進(jìn)行，采用50 cm×30 cm×40 cm的塑料盆，每盆裝土40.0 kg。本試驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組CK（不添加Na3AsO4）和試驗(yàn)組 As－40（添加 40 mg／kg的 Na3AsO4）兩組試驗(yàn)，分別在水稻旺長(zhǎng)期取水稻根系進(jìn)行抗氧化酶活性的檢測(cè)。

1.2 試驗(yàn)材料

隨機(jī)選取5株水稻，剪取根系，洗凈泥沙，用蒸餾水沖洗3～5次，吸干多余水分；取待測(cè)樣品0.5 g，剪碎置于玻璃勻漿器，加5 mL磷酸緩沖液（0.1 mol／L，pH 7.4），冰浴研磨制成勻漿；在低溫（4℃）下離心（轉(zhuǎn)速5000 r／min）10 min，取上清液即為酶粗提液；于－4℃冷藏備用。

1.3 酶試劑盒測(cè)定法

SOD活性檢測(cè)采用總超氧化物歧化酶（T－SOD）測(cè)試盒（A001－1，羥胺法，南京建成科技有限公司）；CAT活性檢測(cè)采用過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)試盒（A007－1，可見(jiàn)光法，南京建成科技有限公司）；POD活性檢測(cè)采用過(guò)氧化物酶（POD）測(cè)試盒（A084－3，南京建成科技有限公司）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 傳統(tǒng)酶檢測(cè)法

采用李合生的方法［17］，并加以改進(jìn)。

SOD活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法檢測(cè)：取酶液100μL，加入3.4 mL反應(yīng)混合液和0.3 mL 20 μmol／L核黃素溶液，混勻，以不加酶液為對(duì)照，對(duì)照管罩黑色硬紙遮光；將測(cè)定管與對(duì)照管同時(shí)置于4000 lx燈下反應(yīng) 20～30 min，于 560 nm處測(cè)定OD值。

POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法檢測(cè)：取分光光度計(jì)比色杯（半徑1 cm），加入反應(yīng)液（含0.1 mol／L pH 6.0的磷酸緩沖液5 mL、愈創(chuàng)木酚28μL、30%H2O219μL）和1 mL酶液，以不加酶液為對(duì)照，混勻，立即計(jì)時(shí)，測(cè)定470 nm處的OD值，每隔1 min讀數(shù)1次。

CAT活性采用紫外分光光度法檢測(cè)：取酶液100 μL，加入 2.9 mL 反應(yīng)液（20 mmol／L H2O2溶液），混勻。以蒸餾水為空白對(duì)照，在反應(yīng)15 s后開(kāi)始記錄反應(yīng)體系于240 nm處的OD值，即為初始值；然后每隔30 s記錄1次，至少測(cè)定6個(gè)點(diǎn)的OD值，重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件和Microsoft Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻根部SOD、CAT和POD活性測(cè)定分析

從圖1中可以看出：用傳統(tǒng)方法測(cè)定的水稻根部SOD的活性略高于用酶試劑盒法測(cè)定的結(jié)果，且SOD活性表現(xiàn)為As－40＞CK，但差異不大；用傳統(tǒng)方法測(cè)定的CAT活性也高于用試劑盒法的檢出值，但兩者間無(wú)顯著差異；用兩種方法檢測(cè)的POD活性值幾乎一致。

圖1 用兩種方法測(cè)定的抗氧化酶活性

2.1.1 SOD檢測(cè)方法的比較 采用酶試劑盒法測(cè)定樣品的SOD活性并以變異系數(shù)對(duì)其精確度進(jìn)行比較，表1顯示酶試劑盒測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)均小于3%，說(shuō)明酶試劑盒測(cè)定結(jié)果精確性好。在相同條件下，采用傳統(tǒng)方法測(cè)定樣品的SOD活性，其變異系數(shù)均大于酶試劑盒測(cè)定的結(jié)果，故在SOD活性檢測(cè)中，酶試劑盒法優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

2.1.2 CAT活性測(cè)定方法的比較 采用兩種方法測(cè)定樣品的CAT活性并以變異系數(shù)對(duì)其精確度進(jìn)行比較。從表2可以看出，酶試劑盒法所測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)均小于傳統(tǒng)方法所測(cè)結(jié)果的，說(shuō)明酶試劑盒測(cè)定結(jié)果的精確性優(yōu)于傳統(tǒng)方法的。這可能是由于傳統(tǒng)方法的操作工序較為繁雜，每個(gè)環(huán)節(jié)都可能影響檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。故在CAT活性檢測(cè)中，采用酶試劑盒法檢測(cè)優(yōu)于傳統(tǒng)方法檢測(cè)。

表1 SOD活性測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)

表2 CAT活性測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)

2.1.3 POD活性測(cè)定方法的比較 采用兩種方法測(cè)定樣品的POD活性并以變異系數(shù)對(duì)其精確度進(jìn)行比較。從表3可知，酶試劑盒法所測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)均小于傳統(tǒng)方法的。這是因?yàn)橛脗鹘y(tǒng)方法測(cè)定時(shí)需要進(jìn)行等時(shí)段的連續(xù)測(cè)定，增加了檢測(cè)的難度，降低了檢出值的準(zhǔn)確度。因此，POD酶試劑盒優(yōu)化了操作過(guò)程，使測(cè)定結(jié)果更穩(wěn)定更準(zhǔn)確。

表3 POD活性測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)

2.2 抗氧化酶活性測(cè)定方法的差異顯著性比較

對(duì)兩種方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行差異顯著性比較，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，3個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的P值均大于0.05，說(shuō)明用2種方法測(cè)得的結(jié)果都無(wú)顯著性差異。

表4 抗氧化酶活性測(cè)定結(jié)果的差異顯著性

2.3 抗氧化酶活性測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性

以傳統(tǒng)方法測(cè)得的數(shù)據(jù)為自變量x，以試劑盒法測(cè)得的數(shù)據(jù)為因變量y，對(duì)兩種方法進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表5。表5的結(jié)果表明，用傳統(tǒng)檢測(cè)方法和酶試劑盒法檢測(cè)的SOD、CAT、POD活性間的相關(guān)系數(shù)都達(dá)到了1，因此可以認(rèn)為兩種方法測(cè)得的3種酶活性基本相同。

2.4 抗氧化酶活性測(cè)定方法的靈敏度比較

對(duì)兩種方法的進(jìn)樣量進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知：在SOD活性檢測(cè)中，傳統(tǒng)檢測(cè)方法的進(jìn)樣量是酶測(cè)定試劑盒法的1.82倍；在CAT活性測(cè)定中，酶測(cè)定試劑盒法的進(jìn)樣量?jī)H為5μL，而傳統(tǒng)檢測(cè)方法的進(jìn)樣量為其20倍；在POD活性測(cè)定中，傳統(tǒng)檢測(cè)方法的進(jìn)樣量為酶試劑盒法的10倍?？梢?jiàn)，酶試劑盒法測(cè)定的靈敏度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)檢測(cè)法的。

表5 抗氧化酶活性測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性分析結(jié)果

表6 兩種抗氧化酶活性測(cè)定方法的進(jìn)樣量比較

酶試劑盒法測(cè)得結(jié)果的變異系數(shù)小于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的，且用兩種方法測(cè)定的結(jié)果無(wú)顯著性差異。綜上所述，在測(cè)定水稻根系SOD、CAT、POD活性時(shí)，酶測(cè)定試劑盒法的測(cè)定結(jié)果可信度高，且操作簡(jiǎn)便。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明：在砷脅迫下，水稻根部SOD、CAT活性受到抑制，這與楊桂娣等［18］的研究結(jié)果一致；而POD活性較對(duì)照升高，這與趙天宏等［19］的研究結(jié)果一致。在測(cè)定水稻根部SOD、CAT、POD活性時(shí)，酶測(cè)定試劑盒法和傳統(tǒng)檢測(cè)方法都可以采用，且兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異。但從精確度方面考慮，采用酶測(cè)定試劑盒法較好。從操作方面考慮，兩種方法均可采用pH 7.4的緩沖液提取3種酶，對(duì)其活性影響不大［20］。在SOD活性檢測(cè)中，傳統(tǒng)檢測(cè)方法需在試劑加完并混勻后，在4000 lx燈下反應(yīng)20～30 min；而酶檢測(cè)試劑盒法只需在室溫下放置10 min，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。在CAT活性檢測(cè)中，傳統(tǒng)檢測(cè)方法需在反應(yīng)15 s時(shí)記錄其在240 nm處的OD值作為初始值，然后每隔30 s記錄1次，至少獲得6個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)，并重復(fù)3次，在結(jié)果計(jì)算中，經(jīng)常由于反應(yīng)時(shí)間的取值范圍不準(zhǔn)確而導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤［21］；而酶檢測(cè)試劑盒法則不需進(jìn)行此操作。在POD活性檢測(cè)中，傳統(tǒng)檢測(cè)方法需在反應(yīng)液與酶液混勻后，立即開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔1 min記錄1次在470 nm處的OD值；但采用酶檢測(cè)試劑盒法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)只需將酶液與反應(yīng)液混勻后離心（3500 r／min，10 min）即可。 可見(jiàn)，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，采用酶檢測(cè)試劑盒法測(cè)定水稻根部 SOD、CAT、POD活性具有操作簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)。

由于不同方法的反應(yīng)原理和酶活性單位的定義不同，且從原料中得到的粗提物酶活力一般較低［22］，因此不同檢測(cè)方法的靈敏度差異較大。以相同取樣量采用傳統(tǒng)檢測(cè)方法測(cè)定不同樣品的酶活性，會(huì)出現(xiàn)抑制率變化甚至難以測(cè)出其酶活性的情況。因此，從靈敏度方面考慮，酶試劑盒法測(cè)定酶活性優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法。

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