黃俊然 黃文超

摘要：三角形五肽重復（PPR）蛋白是植物中一個龐大的蛋白家族，能夠從RNA剪切、編輯、降解和翻譯等多個方面影響細胞器中RNA的新陳代謝，PPR蛋白由連續(xù)的PPR基序構成，蛋白呈右手螺旋結構，具有與RNA單鏈結合的能力。隨著研究的深入，人工設計合成PPR蛋白技術已經(jīng)成熟，PPR蛋白與RNA結合的規(guī)律已較為清晰，人工PPR蛋白有望被開發(fā)成為細胞器中介導RNA調控的新型生物技術。

關鍵詞：三角形五肽重復蛋白;RNA單鏈結合;細胞器RNA調控

中圖分類號：Q74? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）23-0019-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.004? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

PPR（Pentatricopeptide-repeat）蛋白即三角形五肽重復蛋白廣泛存在于植物中，在擬南芥中約有450個PPR基因，在水稻中約有430個。PPR蛋白從RNA剪切、編輯、降解和翻譯等多個方面影響細胞器中RNA的新陳代謝[1，2]。PPR蛋白由2～30個連續(xù)的PPR基序構成，每一個典型的PPR基序包含35個殘基，形成兩個反向平行的α螺旋組成的發(fā)卡結構[3]。PPR蛋白分為兩個亞家族：其中一個是P家族，它的所有PPR基序都由35個氨基酸組成，另一個是PLS家族，與P家族的區(qū)別在于它的基序由31～36個氨基酸構成，并且在其碳端還會有額外的結構域：E，E+以及DYW結構域[1]。對擬南芥中的PPR蛋白進行分析和歸類，發(fā)現(xiàn)含有E，E+及DYW的PPR蛋白分別為191、145及87個。碳端的這些保守結構域的排列是有一定規(guī)律的，在其PPR基序的后面首先會接一個E結構域。而E+結構域必須是在E結構域之后，DYW結構域一般出現(xiàn)在E+結構域之后[4]。

1? PPR蛋白結構呈右手螺旋狀

對擬南芥的PPR蛋白THA8L（thylakoid assembly 8-lke）進行蛋白結晶和晶體結構解析。THA8L蛋白，在葉綠體類囊體膜的生物進程中，參與特定的二類內含子的剪接。THA8L編碼一個PLS家族蛋白，它由3個P型基序及兩側的L基序與S基序組成。THA8L的蛋白晶體顯示，THA8L由11個α螺旋組成。而前10個螺旋主要有5個PPR基序形成，最后一個小的螺旋有助于保護前面PPR基序的10個螺旋結構。THA8L-RNA的復合體結構顯示，THA8L是以二聚體的形式與其RNA底物進行結合[5]。

對PPR10的晶體結構研究顯示，每個PPR基序的35個氨基酸形成一對近似反向平行的α螺旋，每個α螺旋都有4個螺旋轉角，兩個α螺旋之間由兩個氨基酸形成的轉角相連。單個PPR10蛋白由連續(xù)的發(fā)卡型PPR基序扭轉排列而呈右手螺旋結構，兩個PPR10能夠以反向平行的方式形成同源的二聚體，一個PPR10的氮端與另一個PPR10的碳端臨近，形成一個縱向為70？魡，橫向為140？魡的橢圓形構造。每分子的同源二聚體結合兩分子的psaJRNA。在與psaJRNA結合時，蛋白結構會稍微改變，氮端和碳端向中心壓縮，軸向減少20？魡的距離，這一結構上的改變使中間呈現(xiàn)中空的圓筒狀結構，以適應與單鏈RNA的結合。從結構研究中還發(fā)現(xiàn)，PPR10與psaJRNA的結合從蛋白的第三個PPR基序開始[6]。

對擬南芥定PRORP（protein-only RNase P）的晶體結構研究。PRORP1定位在線粒體中，其包含了PPR結構域、鋅結合結構域和典型的金屬核酸酶結構域。PRORP1蛋白呈“V”型，兩個臂（長度各約70？魡）形成約56°的夾角，第一個臂包含了5.5個PPR基序，以11個α螺旋的形式存在于此蛋白的氮端，第二個臂為平行的β折疊兩側伴以α螺旋，兩個臂相匯的中心區(qū)域由反向平行的β折疊構成。僅在植物的PRORP1中發(fā)現(xiàn)，第一個臂的PPR結構域與中心區(qū)域的β折疊之間有一段32個殘基的插入，形成鏈-螺旋-鏈的結構，這一帶正電荷的結構以疏水鍵的方式與PPR結構域相互作用，以離子鍵的方式與中央結構相互作用，促進PPR結構域和金屬核酸酶結構域的協(xié)調，使其發(fā)揮最佳的催化活性。與所有的PPR基序結構類似，PRORP1中連續(xù)的PPR基序也形成了右手超螺旋的結構，在蛋白中成了一個內凹面，面向金屬核酸酶的活性位點[7]。

2? PPR蛋白影響目的RNA代謝

PPR蛋白被認為從維持穩(wěn)定性，編輯和剪切等多個方面影響細胞器中RNA的新陳代謝。許多P家族的PPR蛋白具有RNA結合能力，并且在其碳端不具有其他的功能結構域，這樣的PPR蛋白多是起到協(xié)助RNA修飾，維持RNA穩(wěn)定或者促進其翻譯的作用。LRPPRC是人體中已知的7個PPR蛋白之一，屬于P型亞家族，含有30個PPR基序。因其對線粒體多數(shù)基因都具有轉錄后調控作用，以及它的隱性突變（A354V）會引起嚴重的幼兒線粒體相關神經(jīng)退行而引起關注。LRPPRC與它的互作蛋白SLIRP能夠形成異源二聚體，共同抑制PNPase和SUV3對mRNA的3′端發(fā)揮外切降解的活性，并且還能促進MTPAP（mitochondrial poly（A）polymerase） 介導的mRNA 3′端加尾延伸修飾。在研究中發(fā)現(xiàn)，當LRPPRC和SLIRP存在時，線粒體mRNA的3′端擁有更長的poly（A）尾，這暗示著LRPPRC和SLIRP能夠通過抑制3′端脫腺苷化或3′端外切核苷酸的降解來穩(wěn)定mRNA的活性[8]。在另一項研究中，發(fā)現(xiàn)蛋白SLIRP能夠保持LRPPRC蛋白的穩(wěn)定性，但與RNA的結合能力十分有限。此異源二聚體對RNA的結合能力主要依賴LRPPRC。另外，LRPPRC蛋白四分之二位置的PPR基序和SLIRP的RRM（RNA recognition motif）基序被證實是二者結合最緊密的位置[9]。LRPPRC與SLIRP所形成的異源二聚體能夠結合幾乎所有的線粒體mRNA，保持mRNA的結構穩(wěn)定，并使mRNA上與蛋白翻譯，維持結構穩(wěn)定和多聚核苷酸化等有關的重要位點暴露，保證線粒體基因的正常表達[10]。PPR10在玉米的葉綠體中被發(fā)現(xiàn)，歸屬于P型亞家族，包含19個PPR基序，能夠結合atpI-atpH和psaJ-rpl33兩個轉錄本的基因間區(qū)，所結合的位置具有相似的序列特征，在PPR10的結合下，atpI-atpH和psaJ-rpl33的轉錄本獲得更好的穩(wěn)定性[11]。

PPR蛋白介導RNA的編輯，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的MEF35，包含11個PPR基序的PLS型蛋白，在其碳端存在一個E結構域和一個DYW結構域。它能夠對核糖體亞基基因rpl16轉錄本的第209位核苷酸，細胞色素b基因cob轉錄本的第286位核苷酸和復合體Ⅰ亞基基因nad4轉錄本的第1 373位核苷酸進行脫氨反應，實現(xiàn)堿基由胞嘧啶（C）變成尿嘧啶（U）的編輯，以保證這三個基因的正常表達[12]。小立碗蘚的線粒體轉錄組中存在11處RNA編輯位點，這11處RNA編輯位點的正常編輯，需要至少8種具有DYW結構域的PPR蛋白參與。其中PpPPR_65參與了兩處臨近的RNA編輯位點的編輯：ccmFc-C103和ccmFc-C122。PpPPR_65含有15個PLS特征的PPR基序，在碳端融合了E/E+結構域和DYW結構域，它能夠識別ccmFc-C103上游的位點，將PpPPR_65敲除后，能夠檢測到ccmFc-C103和ccmFc-C122這兩處的編輯現(xiàn)象完全消失。PpPPR_98，包含21個PLS型PPR基序，碳端融合了E/E+結構域和DYW結構域，在PpPPR_98的干涉表達系中可以檢測到atp9-C92位點的編輯效應降低了30%，而余下的10個RNA編輯位點沒有受到影響，進一步研究發(fā)現(xiàn)，PpPPR_98能夠結合在內含子剪切完成后的atp9RNA上，而剪切前的atp9無法被PpPPR_98結合，推測PpPPR_98是在atp9mRNA剪切完成后，參與到第92位胞嘧啶的編輯中[13]。

PPR蛋白參與RNA的剪切。在玉米的葉綠體中發(fā)現(xiàn)的一個較小的PPR蛋白THA8（thylakoid assembly 8），只包含4個PPR基序。研究證實THA8在ycf3和trnA的二型內含子的剪切過程中起作用，將它突變之后，可以觀察到y(tǒng)cf3-2的剪切現(xiàn)象完全消失，trnA的剪切效果大幅降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，THA8不能與ycf3或者trnA的單鏈RNA結合，但是能夠與剪切因子WTF1和RNC1相互作用，這兩個剪切因子同樣參與到了對trnA內含子的剪切中[14]。玉米和擬南芥中的另一個PPR蛋白OTP51同樣參與到了ycf3轉錄本內含子的剪切中，ZmOTP51包含10個PPR基序（AtOTP51包含7個PPR基序）和位于碳端的兩個LAGLIDADGs結構域，LAGLIDADGs結構域被報道具有核酸內切酶活性，在擬南芥中僅有三個蛋白含有此結構域，但是AtOTP51的LAGLIDADGs結構域中缺少維持其核酸內切酶活性的幾個關鍵殘基，將otp51基因敲除突變后發(fā)現(xiàn)對剪切效率的影響遠不如分別對crs1，wtf1和rnc1等剪切因子基因突變后的效果顯著，推測其在對ycf3轉錄本內含子的剪切過程中僅僅起到輔助的作用[15]。

還有部分PPR蛋白，因其具有特殊的功能結構域，對RNA具有相應的作用。PRORP 1（Proteinaceous RNase P 1），含有5.5個PPR基序，在其PPR結構域之后還具有鋅結合結構域和典型的金屬核酸酶結構域，研究發(fā)現(xiàn)它具有RNase P活性，在人體中，以促進tRNA5′端成熟的形式來對線粒體tRNAs的前體進行加工，在擬南芥中以相同的形式介導所有tRNA的加工。在多數(shù)的真核生物中，PRORP都由核基因編碼，但是在酵母的線粒體基因組中也發(fā)現(xiàn)了RNase P的RNA。將PRORP1的氮端8至11個α螺旋截短后，發(fā)現(xiàn)大大降低了它對pre-tRNA的結合能力，同時也影響了PRORP1的催化活性，但沒有明顯降低此蛋白與鋅的結合。由于PRORP1中PPR結構域與蛋白的催化位點較遠，因此認為PPR結構域在此蛋白中的主要作用就是增強了對pre-tRNA的結合能力[7]。

3? PPR與單鏈RNA的結合規(guī)律

PPR蛋白普遍具有與單鏈RNA結合的能力，隨著研究的深入，PPR基序識別特定核苷酸的規(guī)律也逐漸清晰，目前認為，一個PPR基序可以特異性的識別一個核苷酸。

3.1? PPR基序特定殘基與核苷酸結合

在早期對PPR10的結合單鏈RNA：PSAJ和ATPH的序列特征進行研究發(fā)現(xiàn)，它們的5′端和3′端的序列十分相似。識別的序列都從5′-GUAU-3′開始，且3′端的序列為5′-AUUUC-3′，早期從PPR10晶體結構上進行分析，認為一個RNA核苷酸會接近四個殘基，分別是：臨近的兩個PPR基序上的第2位殘基，以及與這一個核苷酸對應的PPR基序上的第5位和第35位殘基。這些殘基的不同組合，可以賦予PPR基序識別與之對應的特定核苷酸的能力[6]。隨著越來越多的PPR蛋白和其結合的RNA序列被研究，發(fā)現(xiàn)每一個基序的第5位和第35位殘基最具有特異結合氨基酸的能力，為了進一步確定PPR基序識別氨基酸的關鍵殘基和識別“密碼”，Shen等人用保守的殘基序列作為PPR基序的骨架，只改變每個PPR基序的第5位和第35位殘基（或者第6位和下一個基序的第1位殘基），設計并表達了四種人工表達的PPR蛋白，用以和特別設計的單鏈RNA進行體外互作驗證，確認了以下識別密碼：當?shù)?位和第35位殘基分別是ND，NS，SN和TD時，能夠對應識別氨基酸U，C，A和G。對這些人工設計的PPR蛋白進行晶體結構研究后發(fā)現(xiàn)，不同于PPR10以同源二聚體來結合兩分子單鏈RNA的模式，它們以單個蛋白的形式來結合目的單鏈RNA，從空間結構分析來看，每個PPR基序的第5位和第35位殘基與氨基酸環(huán)狀官能團十分靠近，進一步研究分析發(fā)現(xiàn)PPR基序與腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）的結合的強度要強于與尿嘧啶（U）和胞嘧啶（C）的結合，因為在與嘧啶的結合中，還需要一分子水來參與形成氫鍵，而與嘌呤可以直接形成氫鍵，并且相較于與腺嘌呤A結合時形成兩個直接的氫鍵，PPR基序與鳥嘌呤G結合時能形成三個氫鍵最為穩(wěn)定[16]。PPR基序第5位和第35位殘基（或者第6位和下一個基序的第1位殘基）的不同組合對應識別核苷酸類型在表1中列出。

3.2? 人工設計PPR蛋白與單鏈RNA結合的特點

與RNA的特異結合，使PPR蛋白具備發(fā)展為生物技術工具的潛力。近期備受關注的由引導RNA介導的（CRISPR）-Cas9基因編輯技術，能夠實現(xiàn)對核基因進行特定堿基的編輯，實現(xiàn)對堿基進行替換，切除或者添加，但是無法對細胞器中的基因進行編輯。而PPR蛋白不需要引導RNA的介導，可以直接通過不同的PPR基序排列，識別特定的單鏈RNA，并且PPR蛋白能夠通過信號肽的幫助進入細胞器中行駛識別和結合單鏈RNA的功能。在與特定功能結構域融合表達后，在轉錄或者轉錄后水平上對細胞器基因的表達進行調控。在最新的研究中，Miranda等人設計了4個人工PPR蛋白，每個人工蛋白都以PPR10的第一個天然基序作為起始基序，后面接以不同數(shù)量的人工設計PPR基序，其中兩個較長的蛋白都含有13個人工設計的PPR基序，這兩個蛋白被設計結合同一RNA序列，但采用不同的PPR基序骨架，一個采用的基序骨架和Shen等人的研究中所采用的一樣，是將所有的PPR基序進行序列比對后，留下各個位置保守性最高殘基而得。另一個骨架的選取策略，是先將PPR基序按照其識別的核苷酸的種類（U，G，C，A）分成四類，然后將相同類別的PPR基序進行序列比對得到保守性最高的殘基信息，作為設計這一類PPR基序的骨架。研究中發(fā)現(xiàn)，以不同的骨架策略設計的PPR蛋白，在對目標單鏈RNA的結合能力上沒有明顯區(qū)別。另外兩個人工PPR蛋白含有10個人工PPR基序，用以研究PPR基序數(shù)量對PPR-RNA結合特異性與親和性的影響，在采用Bind-n-seq實驗將四個人工PPR蛋白與大量的隨機單鏈RNA進行體外結合并測序研究后發(fā)現(xiàn)，當PPR基序數(shù)量為10個時，能夠在結合的特異性和親和性之間達到一個較好的平衡，也就是說，當PPR基序數(shù)量大于10個時，PPR蛋白碳端的PPR基序與單鏈RNA的3′端之間會出現(xiàn)更多的非特異性結合，這一現(xiàn)象和增加CRISPR引導RNA長度的同時，它的堿基錯配率也隨之升高的現(xiàn)象相似。當PPR基序少于10個時，會降低PPR蛋白對目標單鏈RNA的結合強度，這一推測是基于之前的報道：天然的PPR蛋白至少需要6個PPR基序才能檢測到RNA結合能力，如果在體外進行結合，則至少需要8個PPR基序[16，17]。在此研究中還證實，PPR-嘌呤的結合能力和結合特異性，都比PPR-嘧啶更強，PPR-鳥嘌呤的結合對整體結合的特異性和親和力貢獻最大。值得注意的是，PPR基序對錯配的忍耐力還具有一定的位置效應：在對包含11個PPR基序的人工PPR蛋白與隨機RNA序列結合的親和性分析中發(fā)現(xiàn)，位于中間的PPR基序如果發(fā)生錯配，對蛋白和RNA的結合產生的影響最顯著，而位于蛋白兩端，尤其是碳端的PPR基序發(fā)生錯配，對整體的結合影響要相對小一些。PPR蛋白與單鏈RNA結合時，首先是從蛋白的氮端開始與RNA的5′端進行識別和結合，然后結合向蛋白的碳端/RNA的3′端進行延伸，對錯配的忍耐力也隨著增加，在超過10個配對之后，PPR基序-堿基錯配的忍耐力變得顯著而影響PPR蛋白與RNA單鏈結合特異性[18]。

4? PPR蛋白通過自身特殊的結構域或與蛋白互作來行使不同功能

PPR基序具有與單鏈RNA結合的能力，但對目的RNA的新陳代謝產生影響，需要通過其他的功能結構域或者與之相互作用的功能蛋白來實現(xiàn)。自身帶有功能結構域的PPR蛋白，例如擬南芥中的PRORP1（Proteinaceous RNase P1）的碳端具有金屬核酸酶結構域（NYN），其PPR結構域可以結合在pre-tRNAs的D/T-環(huán)上以保護RNA免受核酸酶的降解，同時NYN結構域可以對pre-tRNAs的5′端進行加工，最新研究發(fā)現(xiàn)位于此蛋白第439號位置的賴氨酸對pre-tRNA的切割活性十分重要，而正是PRORP1的切割作用促進目標成熟tRNA的形成[19]。另一類PPR蛋白在末端融合了一個MutS相關結構域（SMR），該結構域在先前的報道中發(fā)現(xiàn)其具有RNA或DNA核酸內切酶的活性。且SMR結構域不是融合在PLS亞家族的蛋白后面，而是融合在P亞家族蛋白的碳端。目前，在被子植物中只發(fā)現(xiàn)8個這樣的蛋白[20]。擬南芥中OTP51蛋白碳端具有退化了的但是被報道具有核酸內切酶活性的LAGLIDADGs結構域。在PLS亞家族蛋白中常見的被認為參與RNA編輯的E/E+和DYW結構域，這些特殊的功能結構域都賦予了與之融合的PPR蛋白相應的生物功能。

另一方面，不包含功能結構域的PPR蛋白可以與其他蛋白相互作用或者影響其他蛋白的作用來行使自己的生物功能，例如人體中的PPR蛋白LRPPRC，它的互作蛋白SLIRP可以與之形成異源二聚體，共同抑制PNPase和SUV3兩種核酸外切酶對 mRNA 的3′端發(fā)揮外切降解的活性，不僅如此，LRPPRC-SLIRP還能促進MTPAP（mitochondrial poly（A） polymerase）所介導的對mRNA 3′端加尾延伸修飾（8）。在玉米的葉綠體中，PPR10結合在atpI-atpH轉錄本的基因間區(qū)，在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，這一結合能夠同時抑制5′端至3′端和3′端至5′端的核酸外切酶的降解作用。同時，由于PPR10的結合，導致RNA的二級結構發(fā)生改變，下游的核糖體結合位點被暴露出來，從而促進了被結合的基因的翻譯表達[21]。玉米中發(fā)現(xiàn)的只包含4個PPR基序的THA8，參與到了兩個基因ycf3和trnA的轉錄本二型內含子的剪切過程中，此蛋白因為只包含少量的PPR基序，不具備與ycf3或者trnA的單鏈RNA結合的能力，但是能夠與剪切因子WTF1和RNC1相互作用，這兩個剪切因子同樣參與到了對trnARNA內含子的剪切之中[14]。紅蓮型水稻中的育性恢復蛋白RF5，屬于PLS家族，不具有結合目標轉錄本atp6-orfH79的能力，但是其互作蛋白GRP162能夠隨其進入線粒體，與目的轉錄本結合，同時，具有WD40結構域的RFC3參與育性恢復蛋白復合體的構建，與RF5，GRP162以及未知的蛋白一起組建成400至500 kDa的復合體，它們共同介導atp6-orfH79轉錄本在第1169位核苷酸處切割，抑制雄性不育蛋白ORFH79的翻譯表達[22，23]。另一個育性恢復基因Rf6，屬于P家族PPR蛋白，包含20個PPR基序，與己糖激酶HXK6相互作用，研究發(fā)現(xiàn)RF6也能與其他蛋白組建成一個蛋白復合體，約400～500 kDa大小，并且RF6不與GRP162相互作用，暗示RF6和RF5所參與形成的蛋白復合體并不一樣。RF6參與的育性恢復復合體，同樣具有對atp6-orfH79轉錄本的剪切功能，于轉錄本的第1238核苷酸處進行切割，抑制ORFH79在線粒體中的積累，進而使雄配子正常發(fā)育成具備育性的成熟花粉[24]。

5? 展望

（CRISPR）-Cas9是當下熱門的基因編輯技術，但無法對細胞器中基因進行編輯。而PPR家族蛋白具備進入細胞器中與單鏈RNA結合的能力，并且識別結合RNA 4種核苷酸的部分PPR基序特點已被研究證實，還有更多的識別密碼正在被研究和驗證。在此基礎上，針對靶標RNA單鏈序列特征，人工設計對應的PPR蛋白，通過融合相應的功能結構域，人工設計融合的PPR蛋白有望成為能夠調控細胞器基因表達的新一代生物技術。

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