邢維新 田振軍

摘 要： 目的：探討運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)大鼠心肌HGF和TGF-β1表達(dá)及其對(duì)心肌細(xì)胞增殖的影響。方法：30只3月齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為安靜對(duì)照組、有氧運(yùn)動(dòng)組和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組，每組10只。安靜對(duì)照組大鼠不運(yùn)動(dòng)，有氧運(yùn)動(dòng)以15 m/min開(kāi)始，遞增速度為3 m/min、時(shí)間為5 min，運(yùn)動(dòng)至速度20 m/min，增加跑臺(tái)坡度為5%，運(yùn)動(dòng)總時(shí)間為60 min，每周訓(xùn)練5天。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)以15 m/min開(kāi)始，遞增速度為3 m/min、時(shí)間為10 min，運(yùn)動(dòng)至速度35 m/min，增加跑臺(tái)坡度為10%，運(yùn)動(dòng)總時(shí)間為90 min，每周訓(xùn)練6天，各組訓(xùn)練時(shí)間均為8周。訓(xùn)練結(jié)束后進(jìn)行HE染色觀察、血流動(dòng)力學(xué)和心電圖測(cè)定，免疫組化和免疫熒光檢測(cè)大鼠心肌PCNA、Ki-67、HGF和TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果：與安靜對(duì)照組相比，有氧訓(xùn)練組大鼠心系數(shù)、LVSP、±dp /dtmax和T波電壓均有顯著性升高（P<0.05），LVEDP和心率均顯著下降（P<0.05），雙核細(xì)胞出現(xiàn)率增加，心肌組織中Ki-67、PCNA 、HGF和TGF-β1的MOD值均顯著升高（P<0.05），Ki-67和PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多;大強(qiáng)度訓(xùn)練組大鼠心系數(shù)、心率、LVED和PQT間期均顯著性升高（P<0.05），LVSP和±dp /dtmax均顯著下降（P<0.05），心肌組織中Ki-67和PCNA和HGF的MOD值下降，其中HGF的下降顯著（P<0.05），TGF-β1的MOD值則顯著升高（P<0.01）。結(jié)論：有氧運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織Ki-67和PCNA的表達(dá)升高，Ki-67和PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，心肌細(xì)胞增殖，有氧運(yùn)動(dòng)上調(diào)HGF和TGF-β1的表達(dá)可能促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的發(fā)生;大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可使心肌組織中Ki-67和PCNA的表達(dá)降低，心肌細(xì)胞增殖抑制;心肌細(xì)胞增殖可能是有氧運(yùn)動(dòng)提高心臟功能的一個(gè)重要機(jī)制。

關(guān)鍵詞： 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練;大鼠;心功能;心肌細(xì)胞增殖

中圖分類號(hào)：G804.2?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1006-2076（2018）06-0084-07

Abstract： Objective：To explore the effect of exercise training on the expression of HGF and TGF-β1 and its effect on the cardiomyocytes proliferation in rats. Methods：30 rats at the age of SD 3 months were divided into 3 groups in random way as normal control group， aerobic sports group and high-intensity training group， with 10 rats each group. Rats in normal control group did not exercise，

The rats in aerobic sports group do exercise at the speed of 15m/min， and then add speed at the rate of 3m/min for 5min， when the speed is 20m/min，5% of the running platform Gradient will be increased，After the rats in aerobic sports group do exercise for Total 60min， and they do training for 5 days per week;The rats in in high-intensity training group do exercise at the speed of 15m/min， and then add speed at the rate of 3m/min for 10 min， when the speed is 35m/min，10% of the running platform Gradient will be increased，After the rats in aerobic sports group do exercise for Total 90min， and they do training for 6 days per week;After the training for each group HE dyeing observation and determination of cardiac function by Hemodynamic and electrocardiogram， the expressions of PCNA， Ki-67， HGF， TGF-β1 in the myocardial tissue of rats have been checked by the way of immunohistochemistry and immunofluorescence. Results：Compared with normal control group， the heart coefficient， LVSP， ±dp/dtmax and T wave voltage of the rats from aerobic sports group have increased dramatically （P<0.05）， while both LVEDP and HR decreased greatly （P<0.05）; There is an increase of occurrence rate of binucleated cell， and MOD of Ki-67， PCNA， HGF and TGB-β1 in the myocardial tissue of rats was rising dramatically （P<0.05）; the number of Ki-67 and PCNA positive cells increased; Meanwhile， the heart coefficient， LVEDP and PQT interphase of the rats in high-intensity group rose dramatically （P<0.05） while their LVSP and ±dp /dtmax decreased greatly （P<0.05）， The MOD of Ki-67， PCNA， HGF decreased in high-intensity group rats， with HGF dropping greatly （P<0.05）; But the MOD of TGB-β1 rose dramatically （P<0.05）. Conclusions：The expression of Ki-67 and PCNA increased， the proliferation of myocardial cell improved， and the number of Ki-67 and PCNA positive cells increased in myocardial tissue of the rats of aerobic exercise group. The increase of HGF and TGB-β1 induced by aerobic exercise may promote the occurrence of the cardiomyocytes proliferation. While the high-intensity exercise can decrease the expression of Ki-67 and PCNA， and inhibit the proliferation of myocardial cell. Myocardial proliferation may be an important mechanism for aerobic exercise to improve heart function.

Key words： exercise training; rats; cardiac function; cardiomyocyte proliferation

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，成熟的心肌細(xì)胞不能進(jìn)行分裂，沒(méi)有增殖能力。然而，心肌細(xì)胞可發(fā)生凋亡已成為一個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí)，從維護(hù)心臟完整的角度推測(cè)心肌中必然存在著細(xì)胞增殖。2000年以來(lái)，隨著科學(xué)研究方法的進(jìn)步和研究技術(shù)的改進(jìn)，心肌細(xì)胞具有分裂增殖能力的證據(jù)越來(lái)越多。Kajstura等研究發(fā)現(xiàn)，從出生到衰老，大鼠心臟中有相當(dāng)比例的心肌細(xì)胞不斷在進(jìn)行著分裂，以補(bǔ)充由于老化而引起的哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞的不斷死亡[1]。隨后諸多學(xué)者證實(shí)在人、大鼠和小鼠的心臟中均存在著細(xì)胞的增殖[2-7]，心肌細(xì)胞增殖可作為心臟損傷后修復(fù)再生的基礎(chǔ)[5，8]。

近年來(lái)，有關(guān)運(yùn)動(dòng)與心肌細(xì)胞增殖的相關(guān)研究引起了國(guó)內(nèi)外廣大學(xué)者的關(guān)注，相繼已有文獻(xiàn)報(bào)道。Waring CD等應(yīng)用Western Blotting研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可使成人心臟心肌細(xì)胞Ki-67和Brdu表達(dá)顯著提高[9]。田振軍等應(yīng)用Western Blotting研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌細(xì)胞PCNA的表達(dá)顯著升高[10]。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor， HGF）是一種多功能的細(xì)胞因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和形態(tài)發(fā)生[11]，對(duì)心梗心肌細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用[12-13]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）可參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等[14]，TGF-β1的高表達(dá)可刺激胚胎的心肌細(xì)胞分化[9]。目前，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)心肌HGF、TGF-β1表達(dá)的影響及其在心肌細(xì)胞增殖中的作用尚缺乏全面的文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用免疫組織化學(xué)與免疫熒光等研究方法探討運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)心肌細(xì)胞增殖因子PCNA、Ki-67及細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF、TGF-β1表達(dá)的影響，并探討HGF、TGF-β1在心肌細(xì)胞增殖中的作用，為運(yùn)動(dòng)性心臟肥大的機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 體重180～220 g的Sprague Dawley 3月齡雄性大鼠30只，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心。1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組、有氧運(yùn)動(dòng)組和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組，每組10只，均按嚙齒類動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食，分每籠5只飼養(yǎng)。大鼠在飼養(yǎng)和訓(xùn)練過(guò)程中，安靜對(duì)照組存活10只，有氧運(yùn)動(dòng)組死亡1只，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠死亡2只。

1.2 大鼠運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案 安靜對(duì)照組大鼠不運(yùn)動(dòng)，正?；\內(nèi)生活。有氧運(yùn)動(dòng)組和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷參照Bedford標(biāo)準(zhǔn)并略加改動(dòng)[15]。有氧運(yùn)動(dòng)以15 m/min開(kāi)始，遞增速度為3 m/min、時(shí)間為5 min，運(yùn)動(dòng)至速度20 m/min，增加跑臺(tái)坡度為5%，運(yùn)動(dòng)總時(shí)間為60 min，每周訓(xùn)練5天。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)以15 m/min開(kāi)始，遞增速度為3 m/min、時(shí)間為10 min，運(yùn)動(dòng)至速度35 m/min，增加跑臺(tái)坡度為10%，運(yùn)動(dòng)總時(shí)間為90 min，每周訓(xùn)練6天，各組訓(xùn)練時(shí)間均為8周。大鼠訓(xùn)練過(guò)程中用小于1 mV的電刺激強(qiáng)迫進(jìn)行。

1.3 心電圖與血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定 8周訓(xùn)練結(jié)束后，次日早晨大鼠腹腔麻醉，心電圖檢測(cè)，主要指標(biāo)有HR、QRS波群間期、QT間期、T波電壓等參數(shù)。RM-6240多導(dǎo)生理記錄儀測(cè)量左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax） 和左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.4 取材與樣品制備 大鼠心電圖和血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定結(jié)束后，迅速取出心臟，生理鹽水沖洗，濾紙吸干稱重，10%的中性甲醛溶液固定。常規(guī)酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟和石蠟包埋，以5 μm厚度連續(xù)切片用于HE染色、免疫組織化學(xué)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)樣品。

1.5 免疫組織化學(xué)與免疫熒光實(shí)驗(yàn) 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)方案：采用SABC法，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。取2套切片用去離子水沖洗，3%H2O2封閉?？乖迯?fù)：Ki-67、PCNA、HGF和TGF-β1微波修復(fù)，PBS沖洗;滴加正常山羊血清20min。滴加一抗： Ki-67、PCNA、HGF和TGF-β1抗體濃度為1[KG-*3]∶[KG-*3]70，4℃過(guò)夜，PBS沖洗;滴加二抗37℃ 20 min，PBS沖洗;滴加SABC 20 min，Tween+PBS混合液沖洗2 h;DAB顯色，蒸餾水沖洗;中性樹(shù)膠封片。染色設(shè)置陰性對(duì)照，即PBS代替一抗，其他程序同上。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)方案：連續(xù)切片嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行，切片常規(guī)脫蠟至水?？乖迯?fù)：Ki-67、PCNA微波修復(fù)20 min，PBS沖洗;正常山羊血清封閉，37℃，45 min。滴加一抗：Ki-67、PCNA、α-肌動(dòng)蛋白抗體濃度為1[KG-*3]∶[KG-*3]200，4 ℃過(guò)夜，Tween+PBS混合液沖洗沖洗30 min，PBS洗3次，每次10 min。滴加二抗（避光）：抗體濃度比為1[KG-*3]∶[KG-*3]50，4 ℃，24 h，Tween+PBS混合液沖洗沖洗30 min，PBS洗10 min×3次（免疫熒光雙標(biāo)再滴加一抗和二抗，步驟同上），甘油磷酸緩沖液封片。染色設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和自發(fā)熒光對(duì)照，分別用陽(yáng)性血清、正常血清和PBS代替一抗。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Olympus光學(xué)顯微鏡高、低倍結(jié)合觀察拍照，再用Image-Pro Plus6.0軟件采集數(shù)據(jù)，計(jì)算平均光密度值（MOD）。運(yùn)用SPSS18.0 for Windows軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用One-Way ANOVA，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[AKX-]±SD）表示。顯著性差異選擇P<0.05和P<0.01水平。免疫熒光化學(xué)圖像采用高、低倍結(jié)合，整體采集，局部放大，Leica TCS SP5激光共聚焦掃描顯微鏡拍片。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠體重、心臟重量及心系數(shù)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與安靜對(duì)照組相比，有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠體重顯著降低（P<0.05）、心臟重量明顯增加（P<0.01）、心系數(shù)顯著升高（P<0.05）;大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠體重顯著下降（P<0.01）、心臟重量明顯增加（P<0.05）、心系數(shù)顯著升高（P<0.05），綜上所述，有氧訓(xùn)練和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)均可使大鼠心臟發(fā)生肥大（見(jiàn)表1）。

2.2 大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和心電圖的變化

2.2.1 大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 與安靜對(duì)照組相比，有氧訓(xùn)練組大鼠LVSP和±dp /dtmax均有顯著性升高（P<0.05），LVEDP顯著下降（P<0.05），表明有氧運(yùn)動(dòng)可顯著提高大鼠心臟的功能;大強(qiáng)度訓(xùn)練組大鼠LVSP和±dp /dtmax均顯著下降（P<0.05）， LVEDP則顯著性升高（P<0.05），表明大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可使大鼠心臟功能下降（見(jiàn)表2）。

2.2.2 大鼠心電圖的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與安靜對(duì)照組相比，有氧訓(xùn)練大鼠心率顯著下降，T波電壓顯著升高（P<0.05），QRS波群間期和QT間期無(wú)顯著變化，表明心臟功能增強(qiáng);疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠心率和QT間期顯著提高（P<0.05），QRS波群間期和T波電壓無(wú)顯著變化，表明心肌收縮時(shí)間延長(zhǎng)，心功能下降（見(jiàn)表3）。

2.3 HE染色觀察結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，安靜對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密整齊，胞漿呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，區(qū)分明顯，偶見(jiàn)雙核心肌細(xì)胞出現(xiàn);有氧運(yùn)動(dòng)大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，肌纖維和細(xì)胞核大小勻稱，排列較安靜對(duì)照大鼠更緊密整齊，染色均勻，雙核細(xì)胞出現(xiàn)率高于對(duì)照組;大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌細(xì)胞肥大、混濁腫脹，肌纖維間隙增大，心肌纖維排列較有氧運(yùn)動(dòng)和安靜對(duì)照大鼠松散紊亂，細(xì)胞間界限模糊，有部分肌纖維斷裂，并在心肌細(xì)胞周圍可見(jiàn)大量紅細(xì)胞，雙核細(xì)胞出現(xiàn)率與安靜對(duì)照組差異不明顯（見(jiàn)圖1）。

2.4 大鼠心肌組織Ki-67、PCNA、 HGF和TGF-β1的免疫組化結(jié)果

在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，Ki-67、PCNA、 HGF和TGF-β1在各組大鼠心肌中均有表達(dá)，Ki-67、PCNA和HGF在心肌細(xì)胞中的表達(dá)見(jiàn)于細(xì)胞核中，TGF-β1主要表達(dá)于心肌細(xì)胞漿。與安靜對(duì)照組相比，有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌組織中Ki-67、PCNA 、HGF和TGF-β1的MOD值均顯著升高（P<0.05），分別升高了18.8%、22.2%、10.8%和13.0%。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則使大鼠心肌組織中Ki-67和PCNA和HGF的MOD值下降，其中HGF的下降顯著（P<0.05），分別下降了6.3%、5.6%、10.8%，TGF-β1的MOD值顯著升高，升高了34.8%（P<0.01（見(jiàn)表4和圖2）。

2.5 大鼠心肌組織Ki-67、PCNA的免疫熒光結(jié)果

激光共聚焦掃描顯微鏡下，α-actinin標(biāo)記為紅色，Ki-67標(biāo)記為綠色，淡黃色表示心肌細(xì)胞核中Ki-67表達(dá)。在正常心肌組織中，淡黃色或黃綠色細(xì)胞很少，偶見(jiàn)心肌細(xì)胞核有表達(dá)，表明Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量很少;與安靜對(duì)照組比較，有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌細(xì)胞淡黃色或黃綠色明顯增多，表明有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多;大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠淡黃色或黃綠色很少，偶見(jiàn)心肌細(xì)胞核有表達(dá)，Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量變化不顯著。α-actinin標(biāo)記為綠色，亮綠色標(biāo)記PCNA。正常心肌組織中，心肌細(xì)胞核偶有亮綠色出現(xiàn)，表明正常心肌組織中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量很少;有氧運(yùn)動(dòng)大鼠亮綠色明顯增多，且主要在心肌細(xì)胞核上，表明有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多;疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠亮綠色出現(xiàn)與安靜對(duì)照組差異不明顯，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量變化不顯著（見(jiàn)圖3）。

3 分析與討論

3.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可對(duì)大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)和心功能產(chǎn)生影響

業(yè)已證實(shí)，有氧運(yùn)動(dòng)可使心臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生良性影響，提升心臟的功能，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則產(chǎn)生相反的結(jié)果。本研究通過(guò)HE染色、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及心電圖測(cè)試結(jié)果表明，有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌纖維排列較安靜對(duì)照組大鼠更緊密整齊，染色均勻，雙核細(xì)胞出現(xiàn)率高于安靜對(duì)照組，同時(shí)心系數(shù)、LVSP和±dp /dtmax及 T波電壓均顯著性升高，LVEDP和HR均顯著下降，表明有氧運(yùn)動(dòng)使大鼠心臟結(jié)構(gòu)產(chǎn)生良性影響，心肌細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性肥大，心率減慢，心輸出量增加，心功能顯著提高;大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使大鼠心肌纖維排列較有氧運(yùn)動(dòng)和安靜對(duì)照大鼠松散紊亂，細(xì)胞間界限模糊，有部分肌纖維斷裂，心系數(shù)、LVEDP和QT間期均顯著性升高，LVSP和±dp /dtmax均顯著下降，表明大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使大鼠心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不良影響，心率加快，心肌收縮時(shí)間延長(zhǎng)，傳導(dǎo)延遲或阻滯，心功能降低。

3.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可對(duì)大鼠心肌細(xì)胞雙核出現(xiàn)率產(chǎn)生影響

1996年Olivetti G等研究表明，人的心肌細(xì)胞有的是單核，有的是雙核，一般單核約占74%，雙核約占25.5%，這一比例不隨年齡、心臟肥大和缺血性心肌病而改變[16]。Bergmann和Kajstura等研究則認(rèn)為，人在生長(zhǎng)過(guò)程中，心肌細(xì)胞會(huì)緩慢更新，且隨年齡下降[5，17]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，山羊出生后超過(guò)50%的心肌細(xì)胞進(jìn)行著胞核分裂，隨著生長(zhǎng)發(fā)育，單核細(xì)胞總數(shù)開(kāi)始下降，雙核細(xì)胞數(shù)量迅速增加[18]。本研究表明，與安靜對(duì)照組相比，有氧訓(xùn)練組大鼠雙核細(xì)胞出現(xiàn)率增加，表明有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌細(xì)胞增殖的細(xì)胞核分裂顯著增加。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠則沒(méi)有差異。

3.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可對(duì)大鼠心肌組織PCNA和Ki-67表達(dá)產(chǎn)生影響

近年來(lái)，心肌細(xì)胞增殖研究成為了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)和體育科學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)重大熱點(diǎn)問(wèn)題，研究?jī)?nèi)容主要集中在不同狀態(tài)下心肌細(xì)胞增殖因子（PCNA、Ki-67和Brdu等）的表達(dá)。

Ki-67抗原是存在于增殖細(xì)胞核的一種非組蛋白性核對(duì)蛋白，由345kd和395kd的兩條多肽鏈組成，與細(xì)胞增殖關(guān)系密切。研究認(rèn)為，Ki-67可評(píng)估細(xì)胞的增生程度，是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志基因[19]。PCNA是DNA 復(fù)制合成過(guò)程中的一種必需的物質(zhì)，并在DNA的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。檢測(cè)PCNA是心肌細(xì)胞分裂增殖研究中一個(gè)常用的方法[20]。1998年以來(lái)，心肌細(xì)胞的增殖研究引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視。Beltrami 等用心肌肌動(dòng)蛋白抗體顯示心肌細(xì)胞，Ki-67作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志，在心肌梗死邊緣區(qū)和遠(yuǎn)距離區(qū)每百萬(wàn)個(gè)心肌細(xì)胞分別檢出800個(gè)及300個(gè)Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞[21]。Quaini 等在研究中發(fā)現(xiàn)，心肌梗死患者左心室心肌細(xì)胞PCNA 陽(yáng)性率高達(dá)49%±19%，而其他相關(guān)報(bào)道多在10%以下[22]。綜上可見(jiàn)，有關(guān)心肌細(xì)胞增殖的研究一直以來(lái)主要集中在心肌梗死的心臟。

近年來(lái)，運(yùn)動(dòng)與心肌細(xì)胞增殖研究亦成為了體育科學(xué)、生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域的一個(gè)重大課題，引起了國(guó)內(nèi)外相關(guān)專家學(xué)者的關(guān)注。目前，有關(guān)運(yùn)動(dòng)促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖因子表達(dá)的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道。Waring等研究表明，與安靜組相比，4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可使大鼠左心室表達(dá)Brdu、ki-67 的心肌細(xì)胞增加，增加的百分比分別為7.2±1.3%和1.9±0.7%[23]。田振軍等學(xué)者運(yùn)用Western Blotting證實(shí)，有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌細(xì)胞PCNA的表達(dá)顯著升高[10]。本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果表明， 與安靜對(duì)照組相比，有氧運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織Ki-67、PCNA分別升高了18.8%、22.2%，提示有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌組織Ki-67、PCNA的表達(dá)顯著升高。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則可使大鼠心肌組織中Ki-67和PCNA的表達(dá)分別下降了6.3%、5.6%，差異不顯著。免疫熒光結(jié)果顯示，在正常心肌組織中，Ki-67、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量很少;有氧運(yùn)動(dòng)可使Ki-67、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多;大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠Ki-67、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量變化不顯著。綜上可見(jiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞增殖，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則抑制大鼠心肌細(xì)胞的增殖。

3.4 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)大鼠心肌HGF 和TGF-β1表達(dá)影響心肌細(xì)胞增殖

近年來(lái)，心肌細(xì)胞增殖及其誘導(dǎo)因素的相關(guān)研究引起了眾多專家學(xué)者的關(guān)注。目前認(rèn)為，HGF和TGF-β1等多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子參與了心肌細(xì)胞增殖的過(guò)程。HGF是由一條含有728個(gè)氨基酸的單鏈前體蛋白裂解而來(lái)的異質(zhì)二聚體。研究發(fā)現(xiàn)，HGF 是一種多功能的細(xì)胞因子，它具有促細(xì)胞增殖、遷移和形態(tài)發(fā)生，在胚胎生長(zhǎng)、組織形成和組織器官修復(fù)中起重要作用[11]。TGF-β是一組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等起調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子超家族，有三種亞型即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可參與細(xì)胞增殖、分化、抑制炎癥、促進(jìn)血管新生、引起心肌細(xì)胞肥大、纖維化 [14]。

目前，有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF和TGF-β1表達(dá)的影響及其在心肌細(xì)胞增殖中的作用研究文獻(xiàn)報(bào)道尚缺。本研究結(jié)果顯示，有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌組織中HGF和TGF-β1的表達(dá)顯著升高，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則可使大鼠心肌組織中HGF的表達(dá)顯著降低，TGF-β1的表達(dá)過(guò)度升高。前文報(bào)道，有氧運(yùn)動(dòng)可以使心肌組織中PCNA、Ki-67的表達(dá)顯著升高，Ki-67、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，心肌細(xì)胞趨于增殖，而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則可使心肌組織中PCNA、Ki-67的表達(dá)下降，心肌細(xì)胞增殖抑制。研究表明，HGF可通過(guò)p27途徑促進(jìn)心肌梗死后心肌細(xì)胞增殖，其下游途徑與心肌細(xì)胞周期蛋白CyclinA/cdk2、CyclinE/cdk2和CyclinD1/cdk4有關(guān)[13]。因此推測(cè)，有氧運(yùn)動(dòng)上調(diào)HGF的表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能為HGF通過(guò)p27途徑，與下游CyclinA、CyclinE、CyclinD1與cdk4等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)有關(guān);大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使HGF的表達(dá)降低則可能抑制了心肌細(xì)胞增殖的發(fā)生。TGF-β1對(duì)細(xì)胞的增殖作用可表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制作用，一般認(rèn)為，低濃度的TGF- β1促進(jìn)細(xì)胞增生，而高濃度時(shí)則抑制細(xì)胞增生。陳章煒等研究表明，新生大鼠心肌細(xì)胞的增殖可能與TGF-β1表達(dá)增高有關(guān)[24]。另有研究表明，TGF-β1的高表達(dá)可刺激胚胎的心肌細(xì)胞分化[9]。由此推測(cè)，TGF-β1參與了大鼠心肌細(xì)胞的增殖，有氧運(yùn)動(dòng)使TGF-β1表達(dá)升高可能促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的發(fā)生;大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)TGF-β1的過(guò)度表達(dá)則會(huì)抑制心肌細(xì)胞的增殖。近年來(lái)，有關(guān)心肌細(xì)胞增殖的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。Bersell K等研究表明，心肌細(xì)胞能夠被NRG1/ErbB4信號(hào)誘導(dǎo)激活，發(fā)生心肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)心肌再生和提升心功能[25]。另有研究表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練調(diào)節(jié)NRG1表達(dá)并激活ErbB2和ErbB4 PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)促進(jìn)內(nèi)源性心肌再生修復(fù)心臟[26]。有氧運(yùn)動(dòng)上調(diào)HGF和TGF-β1表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究仍有待于今后深入研究。

本研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌產(chǎn)生適應(yīng)性肥大，心肌細(xì)胞增殖，TGF-β1參與了肥大和增殖過(guò)程。Bei Y等研究表明，運(yùn)動(dòng)誘發(fā)心臟生理性生長(zhǎng)中心肌細(xì)胞增殖是不必要的，但運(yùn)動(dòng)在保護(hù)缺血再灌注損傷中是必需的[27]，因此，運(yùn)動(dòng)性心肌肥大是否有心肌細(xì)胞增殖產(chǎn)生的心肌細(xì)胞有待今后實(shí)驗(yàn)證實(shí)。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可使大鼠心臟肥大，[JP+1]心肌細(xì)胞增殖抑制，表明大強(qiáng)度訓(xùn)練引起的心臟肥大主要以細(xì)胞體積增大為主。

4 結(jié)論

有氧運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織Ki-67和PCNA的表達(dá)升高，Ki-67和PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，心肌細(xì)胞增殖，有氧運(yùn)動(dòng)上調(diào)HGF和TGF-β1的表達(dá)可能促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的發(fā)生;大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可使心肌組織中Ki-67和PCNA的表達(dá)降低，心肌細(xì)胞增殖抑制;心肌細(xì)胞增殖可能是有氧運(yùn)動(dòng)提高心臟功能的一個(gè)重要機(jī)制。

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