高欣妍， 王海英*， 劉志明， 段曉玲， 馮馨慧

(1. 東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040； 2. 東北林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

金銀忍冬(Loniceramaackii(Rupr.) Maxim.)，也稱金銀木，為忍冬科忍冬屬落葉灌木；葉紙質(zhì)，花芳香；花期為5～6月，果熟期為8～10月；廣泛種植于黑龍江、吉林、遼寧的東部，河北、山東東部以及江蘇、浙江北部等地區(qū)，在朝鮮、日本、蘇聯(lián)遠(yuǎn)東地區(qū)也有分布[1]。金銀忍冬常生于林中或林緣溪流附近的灌木叢中，莖皮可制人造棉，花可提取精油，種子榨油可制肥皂。忍冬(LonicerajaponicaThunb.)，也稱金銀花，藤本，是我國著名的中藥材，具有清熱解毒、消炎退腫的功效，可用于治療細(xì)菌性痢疾等，其有效化學(xué)成分為金銀花次生代謝產(chǎn)物綠原酸、異綠原酸[1]。金銀忍冬(L.maackii)與忍冬(L.japonica)為同屬植物，金銀花在現(xiàn)今生活中用量較大，但金銀忍冬還處于開發(fā)階段[2-3]，研究者希望通過深入研究金銀忍冬，使其能夠作為金銀花的替代品以減少金銀花的使用，因此，近幾年金銀忍冬逐漸成為研究熱點[4-8]。馬俊利等[9-10]從金銀忍冬葉中分離鑒定出6種化合物，分別為木犀草素、金圣草素、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、蘆丁、綠原酸甲酯和綠原酸。還有研究表明金銀忍冬葉和花蕾中均含有綠原酸[11-13]，其花蕾揮發(fā)油提取得率為0.2 %，GC-MS分析鑒定出25種成分，占GC含量的80 %以上[14]。但目前關(guān)于金銀忍冬葉和花中揮發(fā)性成分的研究較少，因此，本研究采用索氏提取法，以正己烷為溶劑，分別提取金銀忍冬鮮葉和鮮花中的活性物質(zhì)，通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法分析其揮發(fā)性成分，并通過抑菌活性實驗分析其抑菌活性，旨在為金銀忍冬的高附加值利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實 驗

1.1原料、試劑和儀器

所采植物經(jīng)鑒定為金銀忍冬(Loniceramaackii(Rupr.) Maxim.)，2015年4月于東北林業(yè)大學(xué)校園采集其鮮葉，2015年5月采集鮮花。正己烷，分析純；甲醇，色譜純。大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)均由東北林業(yè)大學(xué)實驗室提供。索氏提取裝置，定制；7890A-7000B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司。

1.2提取物的制備

采用索氏提取裝置分別提取金銀忍冬鮮葉和鮮花，溶劑為正己烷。分別稱取金銀忍冬鮮葉和鮮花樣品各20 g，剪成2～3 cm的小段，分別用濾紙小心包好并用細(xì)線扎緊后放入濾筒內(nèi)，向濾筒內(nèi)各加入100 mL正己烷溶劑，使樣品完全浸沒在正己烷中。將濾筒放入水浴鍋內(nèi)，連接好索氏提取裝置的各部分，接通冷凝水，于85 ℃水浴加熱，索氏提取4 h。采用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)法除去正己烷，分別得到金銀忍冬鮮葉和鮮花提取物。稱量所得提取物質(zhì)量，計算得率。

1.3提取物的GC-MS分析

分別將金銀忍冬鮮葉和鮮花提取物配制成10 mg/L的甲醇溶液，利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀對試樣進(jìn)行分析。色譜分析條件：HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID檢測器；初始溫度40 ℃，保持2 min，然后以10 ℃/min的升溫速率升到280 ℃并保持2 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL；不分流，氦氣載氣，流速1 mL/min。質(zhì)譜分析條件：EI電離源，接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍為30～500 u。

1.4抑菌活性實驗

1.4.1菌懸液的配制 將供試大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌菌種在斜面試管培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，再利用接種環(huán)從斜面上輕取少量菌苔，分別添加到盛放有50 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，配制1×106個/mL的菌懸液備用[15]。

1.4.2鮮葉提取物抑菌活性試驗 金銀忍冬鮮葉提取物的稀釋(二倍稀釋法)：取6支試管，第1支試管中加入0.76 g金銀忍冬鮮葉提取物，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 %的甲醇溶液，定容至2 mL；另取一只干凈的空白試管，從第1支試管中抽取1 mL金銀忍冬鮮葉提取物-甲醇混合溶液，再加入1 mL 50 %甲醇溶液，輕搖混勻；依次取第3支空白試管，從第2支試管中抽取1 mL金銀忍冬鮮葉提取物-甲醇混合溶液加入到第3支空試管中，再加入1 mL 50 %甲醇溶液，輕搖混勻。依此類推直到第6支試管。6支試管中的金銀忍冬鮮葉提取物質(zhì)量濃度分別為0.38、0.19、0.095、0.047 5、0.023 8、0.011 9 g/mL。采用濾紙片法分別測定金銀忍冬提取物的抑菌活性。用移液槍吸取已配制好的3種菌懸液各100 μL，均勻涂抹在冷卻后的瓊脂平板表面，制成含菌平板。取滅菌濾紙片分別放入6種濃度梯度的金銀忍冬鮮葉提取物中浸泡1 h，將浸泡過的6 mm圓形濾紙片貼在上述制好的含菌平板上，每個培養(yǎng)皿(直徑90 mm)貼上3片浸過同一種質(zhì)量濃度溶液的濾紙片(濾紙片盡量間隔相同)，以50 %甲醇溶液作為空白對照。把處理過的含菌平板置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測定菌落直徑，按以下公式計算抑制率[16-17]：

抑制率=(處理組抑菌圈直徑-空白對照組抑菌圈直徑)/處理組抑菌圈直徑×100 %

1.4.3鮮花提取物抑菌活性試驗 金銀忍冬鮮花提取物的稀釋同樣采用二倍稀釋法：取0.44 g鮮花提取物，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 %的甲醇溶液為溶劑，得到6支試管質(zhì)量濃度分別為0.22、0.11、0.055、0.027 5、0.013 8、0.006 9 g/mL的溶液。同樣采用濾紙片法分別測定金銀忍冬鮮花提取物的抑菌活性，十字交叉法測定菌落直徑，其步驟及抑制率計算公式同1.4.2節(jié)。

1.4.4數(shù)據(jù)處理 采用Excel2007、SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、處理，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；根據(jù)抑制率及相應(yīng)的提取物濃度，通過SPSS19.0軟件計算抑制率為50%時的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1提取物的揮發(fā)性成分分析

2.1.1鮮葉提取物的GC-MS分析 采用索氏提取法以正己烷為溶劑提取得到的金銀忍冬鮮葉提取物為淡黃色透明液體，得率為0.95 %。提取物樣品的總離子流色譜圖如圖1所示，總GC含量92.87 %的化合物被鑒定，共鑒定出34種化合物，通過面積歸一化法計算出各組分的GC含量，結(jié)果如表1所示。

圖 1 金銀忍冬鮮葉提取物的總離子流色譜圖

從表1可知，金銀忍冬鮮葉提取物主要由醇類(31.66 %)、烷烴類(11.88 %)、酯類(10.52 %)、酮類(9.47 %)、濱蒿內(nèi)酯(8.16 %)、醛類(6.40 %)、烯烴類(5.54 %)、異長葉醇甲醚(2.97 %)、D-荷包牡丹堿(1.52 %)、芳烴類(1.06 %)、酚類(1.02 %)、斑蝥素(1.00 %)、菊酯(0.99 %)、木防己苦毒素(0.68 %)組成。GC含量最高的化合物是(-)-異長葉醇(22.63 %)，其次是2,7,10-三甲基-十二烷(10.48 %)。

表 1 金銀忍冬鮮葉提取物的GC-MS分析Table 1 GC-MS analysis of fresh leaves extracts of L. maackii

續(xù)表1

序號No．保留時間/minretentiontime化合物名稱compoundname分子式 molecularformul GC含量/%GCcontent匹配度/%matchingdegree128．948苯乙醛benzeneacetaldehydeC8H8O0．3871．68139．3125?(1?甲基?丙基)?壬烷5?(1?methyl?propyl)?nonaneC13H280．1261．52149．7762，7，10?三甲基?十二烷2，7，10?trimethyl?dodecaneC15H3210．4871．001510．1701，2，3，4?四甲基?苯1，2，3，4?tetramethyl?benzeneC10H140．1380．831611．197萘naphthaleneC10H80．3482．991711．3152?(1?甲基?乙基)?環(huán)己醇2?(1?methyl?ethyl)?cyclohexanolC9H18O0．2963．481811．373斑蝥素cantharidinC10H12O41．0062．561913．4013，7?二甲基?2，6?壬二烯?1?醇3，7?dimethyl?2，6?nonadien?1?olC11H20O0．1868．302013．618(6?羥基?甲基?2，3?二甲基?苯基)?甲醇(6?hydroxy?methyl?2，3?dimethyl?phenyl)?methanolC10H14O20．1877．552113．7623，5?二甲基?苯甲酸甲酯3，5?dimethyl?benzoicacidmethylesterC10H12O20．1775．372215．5503，5?二(1，1?二甲基?乙基)?苯酚3，5?bis(1，1?dimethyl?ethyl)?phenolC14H22O1．0289．272316．2423?(2，6，6?三甲基?1?環(huán)己烯基)?2?丙烯?1?醇3?(2，6，6?trimethyl?1?cyclohexenyl)?2?propen?1?olC12H20O1．8076．352417．1512，3?二氫?4，4?二甲基?吲哚?4?醇?2?酮2，3?dihydro?4，4?dimethyl?indole?4?ol?2?oneC10H11NO26．2676．132517．280(-)?異長葉醇甲醚(-)?isolongifololmethyletherC16H28O2．9767．262617．409(-)?異長葉醇(-)?isolongifololC15H26O22．6365．342717．4972?羥基?4，4，8?三甲基?三環(huán)[6．3．1．0(1，5)]十二烷基?9?酮2?hydroxy?4，4，8?trimethyl?tricyclo[6．3．1．0(1，5)]dodecan?9?oneC15H24O23．2169．532817．5495，9，9?三甲基?5?磷雜?三環(huán)[6．1．1．0(2，6)]?2(6)?癸烯5，9，9?trimethyl?5?phospha?tricyclo[6．1．1．0(2，6)]?2(6)?deceneC12H19P3．1071．642917．681炔咪菊酯imiprothrinC17H22N2O40．9966．423017．954D?荷包牡丹堿D?bicucullineC20H17NO61．5265．743118．072濱蒿內(nèi)酯scoparoneC11H10O48．1668．153218．701木防己苦毒素picrotoxinC30H34O130．6867．513319．4372，4，7，14?四甲基?4?乙烯基?三環(huán)[5．4．3．0(1，8)]十四烷基?6?醇2，4，7，14?tetramethyl?4?vinyl?tricyclo[5．4．3．0(1，8)]tetrade?can?6?olC20H34O2．0168．473420．512鄰苯二甲酸二丁酯dibutylphthalateC16H22O41．1064．57

2.1.2鮮花提取物的GC-MS分析 采用索氏提取法以正己烷為溶劑提取得到的金銀忍冬鮮花提取物為淡黃色透明液體，得率為0.83 %。提取物樣品的總離子流色譜圖如圖2所示。總GC含量70.94 %的化合物被鑒定，共鑒定出30種化合物，通過面積歸一化法計算出各組分的GC含量，結(jié)果如表2所示。

從表2可知，金銀忍冬鮮花提取物主要由酯類(31.33 %)、烷烴類(20.79 %)、酸類(4.93 %)、醇類(4.57 %)、酚類(2.89 %)、醛類(2.82 %)、芳烴類(1.64 %)、酮類(1.61 %)、trans-芳樟醇氧化物(呋喃型化合物)(0.27 %)、香草乳糖苷(0.09 %)組成。GC含量最高的化合物是2,7,10-三甲基-十二烷(14.16 %)，其次是鄰苯二甲酸二丁酯(9.60 %)。

表 2 金銀忍冬鮮花提取物的GC-MS分析

2.2抑菌活性分析

2.2.1鮮葉提取物的抑菌活性分析 空白對照組無抑菌效果，金銀忍冬鮮葉提取物的抑菌活性如表3所示。從表3可以看出，金銀忍冬鮮葉提取物在低質(zhì)量濃度0.011 9 g/mL時對3種供試菌種仍有抑制作用。質(zhì)量濃度為0.19 g/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑制作用最明顯，抑菌圈直徑達(dá)到13.81±1.48 mm，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑制效果較為顯著。半數(shù)抑制濃度(IC50)越小，表示樣品的抑菌活性越高，金銀忍冬鮮葉提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的IC50分別為0.039和0.099 g/mL，對金黃色葡萄球菌的IC50<0.011 9 g/mL?？梢钥闯觯疸y忍冬鮮葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑制活性最強(qiáng)，對3種細(xì)菌的抑制活性的順序為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌。

表 3 金銀忍冬鮮葉提取物的抑菌活性

1)同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同行不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同 different lowercase letters in the same column indicated significant difference(P<0.05),and different capital letters in the same line indicated significant difference(P<0.05),similarly hereinafter

2.2.2鮮花提取物的抑菌活性分析 空白對照組無抑菌效果，金銀忍冬鮮花提取物的抑菌活性如表4所示。從表4可以看出，金銀忍冬鮮花提取物在質(zhì)量濃度0.027 5～0.22 g/mL范圍內(nèi)，對大腸桿菌有較好的抑制作用。對金黃色葡萄球菌抑菌效果最顯著，IC50值最小，為0.053 g/mL；對大腸桿菌的IC50值為0.069 g/mL，對枯草芽孢桿菌的IC50值為0.144 g/mL。金銀忍冬鮮花提取物對3種細(xì)菌抑制活性順序為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌。

表 4 金銀忍冬鮮花提取物的抑菌活性

2.2.3金銀忍冬提取物的抑菌活性比較 殼聚糖具有抑菌活性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑均大于11 mm[18]。殼聚糖-銀納米微粒(CS-Ag NPs)表面修飾前后的木纖維對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、蠟狀芽庖桿菌以及革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌的抑菌率都在 99.0 %以上[19]。飛龍掌血提取物對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑均大于11 mm[20]。高艷清[21]研究結(jié)果表明β-蒎烯衍生物樣品對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為8 mg/L，與對照品新潔爾滅效果相當(dāng)。降解黑荊樹栲膠對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.05 %、0.03 %、0.03 %[22]。由以上分析可知，金銀忍冬鮮葉及其鮮花提取物的抑菌活性較殼聚糖、殼聚糖-銀納米微粒、飛龍掌血提取物、β-蒎烯衍生物、降解黑荊樹栲膠的抑菌活性弱。金銀忍冬鮮葉及其鮮花提取物的抑菌活性有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

3.1以正己烷為溶劑，采用索氏提取法，分別提取金銀忍冬鮮葉和鮮花中的活性物質(zhì)，并通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法分析其揮發(fā)性化學(xué)成分。分析結(jié)果表明：金銀忍冬鮮葉提取物中總GC含量92.87 %的化合物被鑒定，共鑒定出34種化合物；GC含量最高的化合物是(-)-異長葉醇(22.63 %)，其次是2,7,10-三甲基-十二烷(10.48 %)。金銀忍冬鮮花提取物中總GC含量70.94 %的化合物被鑒定，共鑒定出30種化合物；其中GC含量最高的化合物是2,7,10-三甲基-十二烷(14.16 %)，其次是鄰苯二甲酸二丁酯(9.60 %)。

3.2抑菌活性分析結(jié)果表明：金銀忍冬鮮葉提取物在低質(zhì)量濃度0.011 9 g/mL時對3種供試菌種均有抑制作用。提取物質(zhì)量濃度為0.19 g/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑制作用最明顯，抑菌圈直徑達(dá)到13.81±1.48 mm；對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑制效果較為顯著，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的IC50分別為0.039和0.099 g/mL，對金黃色葡萄球菌的IC50<0.011 9 g/mL，因此，金銀忍冬鮮葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑制活性最強(qiáng)；對3種細(xì)菌抑制活性順序為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌。金銀忍冬鮮花提取物在質(zhì)量濃度0.027 5～0.22 g/mL范圍內(nèi)，對大腸桿菌有較好的抑制作用，對金黃色葡萄球菌抑菌效果最顯著，IC50值最小，為0.053 g/mL；對大腸桿菌的IC50值為0.069 g/mL，對枯草芽孢桿菌的IC50值為0.144 g/mL；對3種細(xì)菌抑制活性順序為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌。

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