丁振中，馮小海，張超，雷鵬，史勁松，李恒

（1.揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司，江蘇揚(yáng)州 225601；2.江南大學(xué)，江蘇無錫 214122）

氨基葡萄糖簡(jiǎn)稱氨糖，化學(xué)名稱為2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，其作為營(yíng)養(yǎng)品和藥品具有廣泛的應(yīng)用，是骨關(guān)節(jié)炎的膳食補(bǔ)充劑和臨床治療的輔助用藥，能夠強(qiáng)化軟骨結(jié)構(gòu)，預(yù)防關(guān)節(jié)病變，修復(fù)骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的軟骨受損，舒緩關(guān)節(jié)炎引起的疼痛、僵硬和腫脹[1]。隨著世界范圍內(nèi)人口結(jié)構(gòu)的老齡化，骨關(guān)節(jié)炎患者越來越多，氨糖作為膳食補(bǔ)充劑被大量用于骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和輔助治療，全球氨糖市場(chǎng)已發(fā)展到3萬噸的規(guī)模，制品產(chǎn)業(yè)鏈總產(chǎn)值在40億美元左右，具有廣闊的市場(chǎng)前景[2]。

然而，隨著氨糖市場(chǎng)的快速發(fā)展，其產(chǎn)品品質(zhì)和原料來源問題逐漸突出。目前，市場(chǎng)上的氨糖主要為甲殼源氨糖，是以蝦蟹殼為原料，通過脫脂、去鈣等步驟進(jìn)行生產(chǎn)，雖然產(chǎn)品純度能夠滿足醫(yī)藥和食品標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在微量過敏因子，易引發(fā)皮疹、騷癢、過敏性哮喘等癥狀[3-4]。近年來，國(guó)際市場(chǎng)上產(chǎn)生了安全性更好的植物源氨糖，其原料不是來自動(dòng)物甲殼素，而是來自植物原料轉(zhuǎn)化而成的真菌幾丁質(zhì)[5]。

本研究采用工業(yè)發(fā)酵檸檬酸的廢棄玉米渣（含菌絲體）和食用菌工廠化栽培產(chǎn)生的大量菌根、菌渣為原料生產(chǎn)植物源氨糖。研究創(chuàng)新的使用生物轉(zhuǎn)化富集技術(shù)，通過對(duì)基料進(jìn)行組分調(diào)整，再接種綠色木霉進(jìn)行生物質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高原料幾丁質(zhì)含量；同時(shí)，首次使用物理場(chǎng)輔助催化技術(shù)，采用超聲波-酸解聯(lián)用技術(shù)，減少酸堿用量，提高水解度。

1 材料與方法

1.1 菌種

綠色木霉（Trichoderma viride），由揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司研發(fā)部自主分離并保藏于公司研發(fā)中心，本研究所用菌劑為揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司自主制備的綠色木霉粉劑，有效活菌數(shù)≥109/g。

1.2 廢棄物基質(zhì)來源

工業(yè)發(fā)酵檸檬酸的廢棄玉米渣（含菌絲體），食用菌生產(chǎn)菌渣。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

玉米渣，食用菌渣，玉米粉，(NH4)2SO4，KH2PO4，吐溫80。

1.4 發(fā)酵工藝

將玉米渣、食用菌渣按一定比例混合為復(fù)配基質(zhì)，然后再向復(fù)配基質(zhì)中加入玉米粉12%、(NH4)2SO42.5%、KH2PO41.5%、吐溫80 0.5%，加入適量的水，攪拌均勻后進(jìn)行滅菌處理，冷卻后拌入2.5%的綠色木霉粉劑。拌料均勻后淺盤發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間為48 h。

1.5 發(fā)酵基質(zhì)中氨基葡萄糖含量檢測(cè)

氨基葡萄糖的提取按照Guerriero等人的方法[6]。稱取1 g發(fā)酵前或發(fā)酵后基質(zhì)，在研缽內(nèi)用液氮研磨成粉末，然后懸浮于2mL去離子水中，13 000 g離心10 min，棄上清，將沉淀在冷凍干燥機(jī)中過夜凍干。稱取凍干后的粉末5 mg，加入1mL 6mmol HCl，置于100℃水浴中4 h，隨后冷卻至室溫，吸取0.2mL測(cè)定氨基葡萄糖含量。

氨基葡萄糖按照Morgan-Elson方法檢測(cè)[7]。取0.2mL待測(cè)液加入乙酰丙酮試劑1.0mL，90℃水浴1 h，冷卻至室溫，慢慢加入10mL 96%乙醇，然后加入DMAB試劑1.0mL，混合均勻?；旌虾笫覝胤胖? h，530 nm處比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算胞內(nèi)氨基葡萄糖的產(chǎn)量。

乙酰丙酮試劑配制：1.5mL乙酰丙酮，溶于50mL 1.25 mol/L碳酸鈉溶液中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

DMAB試劑配制：1.6 g對(duì)二甲氨基苯甲醛（DMAB）溶于30mL濃鹽酸和30mL 96%的乙醇中，-4℃保存。

1.6 氨基葡萄糖粗提液制備

將發(fā)酵后的菌絲體復(fù)合物置于真空冷凍干燥機(jī)中，設(shè)置真空度為-2 MPa，溫度為-10℃，真空冷凍處理24 h。然后向發(fā)酵菌絲體復(fù)合物中加入0.2 mmol 20%醋酸溶液，攪拌30 min后置于超聲儀中，設(shè)置超聲功率為60 W、溫度為40℃、時(shí)間為20 min，抽濾即可得到含有氨基葡萄糖的粗提取液。按照1.5中的Morgan-Elson方法測(cè)定粗提液中氨基葡萄糖含量，并計(jì)算氨基葡萄糖提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米渣、食用菌渣復(fù)配比例對(duì)發(fā)酵氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響

真菌中氨基葡萄糖主要來自于細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的水解。如圖1所示，玉米渣與食用菌渣復(fù)配時(shí)，較高的玉米渣含量有利于綠色木霉菌的生長(zhǎng)，從而提高菌絲體中幾丁質(zhì)的含量。當(dāng)玉米渣-食用菌渣配比2∶1時(shí)，最有利于菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生幾丁質(zhì)，因而氨基葡萄糖含量最高。較低的玉米渣配比則不利于菌體生長(zhǎng)。檸檬酸發(fā)酵玉米渣中，總糖含量高達(dá)35%以上[8]，且以易被生物利用的淀粉為主，在發(fā)酵過程中，玉米渣作為主要碳源給菌體生長(zhǎng)提供必要的能量，因此，玉米渣含量較高時(shí)有利于菌體的生長(zhǎng)。而食用菌菌渣中主要營(yíng)養(yǎng)成分為粗蛋白，在發(fā)酵過程中為綠色木霉提供氮源，此外食用菌菌渣還富含微量元素，在高配比時(shí)，過多的微量元素不利于綠色木霉的生長(zhǎng)[9]。

圖1 玉米渣-食用菌渣配比對(duì)綠色木霉產(chǎn)氨基葡萄糖的影響

2.2 初始含水量對(duì)綠色木霉發(fā)酵氨基葡萄糖的影響

本研究考察了初始含水量為45%、50%、55%、60%、65%和70%時(shí)，綠色木霉發(fā)酵產(chǎn)氨基葡萄糖（幾丁質(zhì)水解）的規(guī)律，如圖2所示。含水量較低時(shí)，不利于綠色木霉菌絲體的生長(zhǎng)，隨著含水量的增加，菌絲體生長(zhǎng)加快，幾丁質(zhì)含量增加，氨基葡萄糖產(chǎn)率高，當(dāng)含水量為60%時(shí)，氨基葡萄糖含量達(dá)到最高15.1%，繼續(xù)增加培養(yǎng)基水分含量則會(huì)降低菌體生長(zhǎng)。水分含量是綠色木霉固態(tài)發(fā)酵中的重要參數(shù)，水分含量過高，會(huì)造成固體物料結(jié)塊，導(dǎo)致孔隙度降低，響固態(tài)過程中的氧的傳遞和熱量的交換；而水分不足則會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不充分利用，引起微生物生長(zhǎng)緩慢、目標(biāo)產(chǎn)物合成效率較低[10]。

圖2 含水量對(duì)綠色木霉固態(tài)發(fā)酵氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響

2.3 玉米渣-食用菌渣復(fù)配基質(zhì)處理前后氨基葡萄糖含量對(duì)比

本研究對(duì)比了玉米渣-食用菌渣復(fù)配基質(zhì)（復(fù)配比為2∶1）在用綠色木霉發(fā)酵前后氨基葡萄糖的含量變化。如圖3所示，發(fā)酵前，復(fù)配基質(zhì)中的氨基葡萄糖含量?jī)H為5.7%，經(jīng)綠色木霉生物轉(zhuǎn)化后，復(fù)配基質(zhì)中的氨基葡萄糖含量達(dá)到15.4%，氨基葡萄糖含量提高了9.7%，這說明使用綠色木霉確實(shí)能夠轉(zhuǎn)化檸檬酸發(fā)酵玉米渣及食用菌渣這些工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物，使其變廢為寶，成為具有工業(yè)化前景的氨基葡萄糖來源。

圖3 發(fā)酵前后玉米渣-食用菌渣復(fù)配基質(zhì)中氨基葡萄糖含量變化

2.4 超聲-酸解聯(lián)合制備氨基葡萄糖粗提液工藝優(yōu)化

本研究考察了超聲時(shí)間為60 min，超聲溫度為80℃時(shí)，不同超聲功率對(duì)提取液中氨基葡萄糖得率的影響，結(jié)果見表1。隨著超聲功率的增大，粗提液中氨基葡萄糖得率增加，當(dāng)超聲功率在60～80 W時(shí)，粗提液中氨基葡萄糖得率變化不大，從經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)的角度考慮，以60 W作為最佳提取功率。

表1 超聲功率對(duì)粗提液中氨基葡萄糖得率的影響

考察在超聲功率為60 W，超聲溫度為80℃時(shí)，超聲時(shí)間對(duì)粗提液中氨基葡萄糖得率的影響，結(jié)果見表2。隨著超聲時(shí)間的增加，綠色木霉菌絲體中的幾丁質(zhì)逐漸釋放到溶液中，并且在酸環(huán)境中水解為氨基葡萄糖，超聲時(shí)間越長(zhǎng)，粗提液中氨基葡萄糖得率越高，當(dāng)超聲時(shí)間為40～60 min時(shí)，粗提液中的氨基葡萄糖得率達(dá)到最高值，且變化不再顯著。因此，從經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)的角度考慮，本研究采用40 min作為最佳超聲時(shí)間。

表2 超聲時(shí)間對(duì)粗提液中氨基葡萄糖得率的影響

考察在超聲功率為60 W，超聲時(shí)間為40 min時(shí)，超聲溫度對(duì)粗提液中氨基葡萄糖得率的影響，結(jié)果見表3。隨著溫度的提高，菌絲體上的幾丁質(zhì)釋放量及水解程度增加，粗提液中的氨基葡萄糖含量增加。當(dāng)溫度達(dá)到60℃以上后，粗提液中氨基葡萄糖得率最高，且不再隨溫度升高有顯著變化。從節(jié)能生產(chǎn)的角度考慮，確定最佳的超聲提取溫度為60℃。

表3 超聲溫度對(duì)粗提液中氨基葡萄糖得率的影響

采用物理場(chǎng)輔助催化技術(shù)，可簡(jiǎn)化幾丁質(zhì)分離和降解過程，使酸堿耗量大幅度降低，并使資源化利用成為可能。本研究利用超聲波的空化效應(yīng)，使菌絲體表面破碎，有利于菌絲體細(xì)胞壁充分剝離。由于幾丁質(zhì)主要存在于細(xì)胞壁中，后續(xù)的酸解僅對(duì)分離出的細(xì)胞壁進(jìn)行，而避免同時(shí)水解其他有機(jī)質(zhì)，該項(xiàng)技術(shù)可以大幅度減少后續(xù)的酸堿耗量[11]。

3 結(jié)論

本研究創(chuàng)新性的使用生物轉(zhuǎn)化富集技術(shù)，通過對(duì)工農(nóng)業(yè)廢棄基料進(jìn)行組分調(diào)整和預(yù)處理，再接種綠色木霉利用淺盤固態(tài)發(fā)酵法進(jìn)行二次生物質(zhì)轉(zhuǎn)化，確立了最佳的玉米渣-菌渣復(fù)配比（2∶1）和發(fā)酵初始含水量（60%），使原料氨基葡萄糖（幾丁質(zhì)水解）含量提高了9.7%，突破了原料幾丁質(zhì)含量低導(dǎo)致的高成本瓶頸。此外，本研究首次使用物理場(chǎng)輔助催化技術(shù)，采用超聲波-酸解聯(lián)用技術(shù)，確立了最佳超聲強(qiáng)度（60 W）、最佳超聲時(shí)間（40 min）和最佳超聲溫度（60℃），減少了酸堿用量，提高水解度，解決了幾丁質(zhì)分離降解過程中酸用量大的問題，使粗提液中氨基葡萄糖得率達(dá)到90%以上。本技術(shù)可再生利用工業(yè)發(fā)酵檸檬酸的廢棄玉米渣（含菌絲體）和食用菌工廠化栽培產(chǎn)生的大量菌根、菌渣，實(shí)現(xiàn)了大宗廢棄物的資源化和高值化利用，對(duì)農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收和產(chǎn)業(yè)環(huán)境的改善具有重要意義。

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