李婷，朱潘紅，齊慧紅，周春霞，洪鵬志

(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江，524088)

魚(yú)類(lèi)肌肉中最主要的蛋白是肌原纖維蛋白，約占總蛋白含量的60%～70%，而肌球蛋白又是肌原纖維蛋白“粗絲”的主要組成成分，是一類(lèi)由2個(gè)球狀頭部和一個(gè)棒狀尾部組成的不對(duì)稱(chēng)大分子，長(zhǎng)約160 nm，以“Y”形狀態(tài)存在，占肌原纖維蛋白的55%～60%[1]。肌球蛋白為鹽溶性蛋白，在體外低離子強(qiáng)度(<200 mmol/L KCl)下不溶，為纖絲狀聚合物，但隨著鹽濃度的增加，高離子強(qiáng)度(600 mmol/L KCl)下肌球蛋白纖絲會(huì)逐漸解離[2-3]形成單體。溫度也會(huì)影響肌球蛋白單體或低聚物的自組裝，肌球蛋白受熱會(huì)發(fā)生變性、聚集。肌球蛋白的鹽溶特性和熱變性一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。養(yǎng)殖暹羅鱷肌原纖維蛋白在低離子強(qiáng)度(0.1～0.2 mol/L NaCl)條件下溶解度差，隨著離子強(qiáng)度的升高(0.4～1.0 mol/L NaCl)，肌原纖維蛋白的溶解度增大，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到1.0 mol/L，溶解度達(dá)到最大[4]；經(jīng)0.3 mol/L鹽溶液透析過(guò)的秘魯魷魚(yú)肌球蛋白改用0.5 mol/L鹽溶液進(jìn)行再透析，其溶解度明顯升高[5]；雞胸肉肌球蛋白在高鹽濃度下溶解度較好，在0.2～0.8 mol/L KCl范圍內(nèi)，隨著KCl濃度的上升，溶解度增大[6]，由此也會(huì)影響肌球蛋白的熱變性及相關(guān)特性。對(duì)鯉魚(yú)肌球蛋白熱處理研究表明，34 ℃時(shí)肌球蛋白頭部開(kāi)始發(fā)生聚集，形成凝膠，儲(chǔ)能模量增加[7]；兔骨骼肌肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度在30～50 ℃范圍內(nèi)隨著溫度升高而增強(qiáng)，溫度繼續(xù)升高，凝膠強(qiáng)度基本穩(wěn)定[8]。這些研究對(duì)肌球蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠機(jī)制進(jìn)行了深入的探討，但是關(guān)于低鹽條件下肌球蛋白的熱聚集變性方面的研究較少。

低鹽魚(yú)糜食品是當(dāng)前相關(guān)加工業(yè)的主流產(chǎn)品，水產(chǎn)蛋白的不穩(wěn)定性嚴(yán)重制約了水產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和精加工。肌球蛋白是魚(yú)類(lèi)蛋白的主要功能性蛋白質(zhì)，研究低離子強(qiáng)度下的肌球蛋白增溶對(duì)水產(chǎn)蛋白的加工具有實(shí)際指導(dǎo)意義。因此，本文以羅非魚(yú)肌球蛋白為研究對(duì)象，在不同離子強(qiáng)度(1、50、150、300、600 mmol/L KCl)下進(jìn)行熱處理(40、50、60、70、80 ℃)，分析不同條件下肌球蛋白結(jié)構(gòu)的變化，為低鹽水產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羅非魚(yú)，購(gòu)于湛江市工農(nóng)市場(chǎng)(2017.04～2017.05)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室處理，取其背部白肉部分，低溫保存。所有操作均在4 ℃環(huán)境中進(jìn)行。

KCl、(NH4)2SO4、三羥基甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)等，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠；二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、六水合氯化鎂等，購(gòu)于廣州光華科技股份有限公司；5-腺苷三磷酸二鈉鹽(ATP)、馬來(lái)酸和二硫蘇糖醇(DTT),購(gòu)于廣州齊云生物技術(shù)有限公司；乙二醇雙(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA),購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；8-苯胺基萘-1-磺酸(1,8-ANS),購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；快速Lowery法蛋白含量測(cè)定試劑盒,購(gòu)于上海荔達(dá)生物科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-20HT恒溫水浴鍋,英國(guó)Bibby Scientific有限公司；UV757紫外分光光度計(jì),上海精科實(shí)業(yè)有限公司；RF-5301P熒光分光光度計(jì),日本島津公司；Chirascan圓二色譜儀,英國(guó)應(yīng)用光物理公司；Nano-2s MPT-2納米粒度分析儀,英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

1.3.2 不同離子強(qiáng)度下肌球蛋白樣液的制備

將肌球蛋白原液分別用不同離子強(qiáng)度的溶液(20 mmol/L Tris-HCl，KCl濃度分別為1、50、100、150、300、600 mmol/L，pH 7.0)，透析24 h，檢測(cè)蛋白濃度，并用對(duì)應(yīng)的透析液稀釋到2.0 mg/mL[11]，即得不同離子強(qiáng)度下的肌球蛋白溶液。

1.3.3 肌球蛋白樣液的熱處理

將蛋白溶液分別進(jìn)行水浴熱處理，控制升溫速率約為1 ℃/min。升溫過(guò)程中，當(dāng)樣液中心溫度達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)置的溫度(40、50、60、70、80 ℃)條件時(shí)[8]，取出蛋白溶液迅速在冰水中冷卻至4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 濁度的測(cè)定

取熱處理后的蛋白樣液稀釋至0.5 mg/mL，在波長(zhǎng)為350 nm處測(cè)定吸光度A350 nm，即為樣品的濁度[12]。

1.3.5 溶解度的測(cè)定

將熱處理后的蛋白溶液離心(50 000×g，15 min，4 ℃)取上清液，采用lOWRY法[10]測(cè)其蛋白含量。肌球蛋白的溶解度按離心所得上清液中蛋白濃度占未處理前溶液中總蛋白濃度的百分比計(jì)算。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.6 表面疏水性的測(cè)定

采用ANS熒光探針?lè)╗13]檢測(cè)。將熱處理后的蛋白溶液逐步稀釋至(0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL)，各取4 mL，分別加入20μL的ANS溶液(8.0 mmol/L ANS，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 7.0)，混勻后靜置10 min(避光)，測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度(FI)。所用的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為374 nm和485 nm，狹縫寬為5 nm。將添加探針的樣品熒光強(qiáng)度值減去對(duì)應(yīng)樣品的內(nèi)源熒光強(qiáng)度值即為蛋白質(zhì)的相對(duì)熒光強(qiáng)度值(RFI)。以RFI對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，其初始段的斜率作為蛋白質(zhì)的表面疏水性指標(biāo)(ANS-S0)。

1.3.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

取適量肌球蛋白溶液，用對(duì)應(yīng)緩沖液稀釋至100 μg/mL，用儀器控溫程序進(jìn)行熱處理，進(jìn)行圓二色譜測(cè)定。波長(zhǎng)掃描范圍為190～260 nm，樣品池光徑為1 mm，測(cè)量溫度為4 ℃，以緩沖液做空白，實(shí)驗(yàn)值為掃描3次的均值，α-螺旋含量的計(jì)算見(jiàn)公式(1)、(2)[14]：

(1)

(2)

式中：[θ]obs為222 nm處的橢圓率，mdeg；[θ]222為222 nm處的摩爾橢圓率，deg·cm2/dmol；Mw為肌球蛋白的平均殘基分子質(zhì)量，取115 g/mol[12]；C為肌球蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；L為比色皿光程長(zhǎng)度，cm。

1.3.8 粒徑的測(cè)定

利用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(DLS)，采用He-Ne激光在633 nm下對(duì)熱處理前后的蛋白溶液(1.0 mg/mL)進(jìn)行粒徑的測(cè)定，用90°散射角對(duì)樣品進(jìn)行除塵，室溫下穩(wěn)定1 min后進(jìn)行測(cè)試[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)測(cè)定均重復(fù)操作3次，數(shù)據(jù)均用Origin 7.5處理，利用JMP 7.0分析方差，使用多重比較進(jìn)行差異顯著性(p<0.05)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同離子強(qiáng)度條件下熱處理對(duì)肌球蛋白體系濁度的影響

不同離子條件下升溫?zé)崽幚?40、50、60、70、80 ℃)對(duì)肌球蛋白體系濁度的影響結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，熱處理前后肌球蛋白體系的濁度隨離子強(qiáng)度的升高而下降。當(dāng)KCl濃度為1 mmol/L時(shí)，肌球蛋白分子聚集呈纖絲[2]，體系渾濁，可檢測(cè)的濁度值最大(p<0.05)；升溫處理至40 ℃時(shí)，體系濁度明顯增大(p<0.05)，且隨著熱處理的溫度升高，濁度進(jìn)一步增大；當(dāng)溫度升高到70 ℃時(shí)，體系呈現(xiàn)弱凝膠狀態(tài)，體系熱穩(wěn)定性差；而隨著鹽濃度的增大，肌球蛋白纖絲逐漸解聚，當(dāng)KCl濃度為50～150 mmol/L時(shí)，未經(jīng)熱處理的肌球蛋白體系濁度明顯下降(p<0.05)，經(jīng)熱處理后，解聚的蛋白分子變性聚集，體系濁度增大(p<0.05)；但隨著KCl濃度增大至300～600 mmol/L時(shí)，高濃度的鹽離子會(huì)破壞分子間靜電相互作用，肌球蛋白呈單體或二聚體狀態(tài)[15]，溶液澄清透亮，且經(jīng)40 ℃熱處理后，濁度變化不明顯，但當(dāng)溫度升高到50～80 ℃時(shí)，解離的肌球蛋白分子變性聚集，濁度增大。因此，低鹽條件(<300 mmol/L KCl)下肌球蛋白熱穩(wěn)定性極差，易發(fā)生聚集沉淀。

圖1 不同離子強(qiáng)度條件下熱處理過(guò)程中羅非魚(yú)肌球蛋白體系濁度的變化Fig.1 Changes of turbidity of tilapia myosin during heating process at various ionic strengths

2.2 不同離子強(qiáng)度條件下熱處理對(duì)肌球蛋白溶解度的影響

將熱處理后的肌球蛋白體系進(jìn)行高速離心，檢測(cè)其可溶性蛋白含量。由圖2可知，當(dāng)KCl濃度為1 mmol/L時(shí)，肌球蛋白分子聚集呈纖絲[2-3]，溶解性極差，未經(jīng)熱處理時(shí)肌球蛋白溶解度約30%，經(jīng)熱處理后分子運(yùn)動(dòng)加劇，分子間聚集沉淀[16]，溶解度進(jìn)一步降低至6%左右；當(dāng)KCl濃度增加到50～150 mmol/L時(shí)，肌球蛋白纖絲逐漸解聚蛋白部分溶解，溶解度增加，但體系仍然渾濁；隨著熱處理的進(jìn)行，當(dāng)溫度升高到50 ℃時(shí)，肌球蛋白幾乎完全聚集沉淀，溶解度極低；當(dāng)KCl濃度升高到300～600 mmol/L時(shí)，高濃度的鹽離子破壞分子間的靜電相互作用，抑制絲狀體形成，分子以單體或可溶性寡聚體形式存在[15, 17]，肌球蛋白溶幾乎完全可溶，且經(jīng)40 ℃熱處理后，體系可溶性蛋白含量變化不明顯(p<0.05)，這與濁度的檢測(cè)結(jié)果一致。由此推測(cè)高鹽對(duì)肌球蛋白分子有保護(hù)作用。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高到50 ℃，300 mmol/L KCl下的肌球蛋白體系出現(xiàn)明顯沉淀，溶解度下降(p<0.05)，而600 mmol/L KCl下的肌球蛋白溶解度下降較小，且溫度上升到80 ℃時(shí)，體系溶解度仍高于60%，表明中性鹽的存在可能在一定溫度范圍內(nèi)提高了肌球蛋白熱變性溫度。

圖2 不同離子強(qiáng)度條件下熱處理過(guò)程中羅非魚(yú)肌球蛋白溶解度的變化Fig.2 Changes of solubility of tilapia myosin during heating process at various ionic strengths

2.3 不同離子強(qiáng)度條件下熱處理對(duì)肌球蛋白表面疏水性的影響

8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS)是一種陰離子型熒光探針，可以通過(guò)疏水作用和靜電相互作用與蛋白質(zhì)分子表面的疏水基團(tuán)結(jié)合[18]，由此反映蛋白質(zhì)分子表面疏水性的大小。如圖3所示，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，未經(jīng)熱處理的實(shí)驗(yàn)組可溶性肌球蛋白分子表面疏水性均隨離子強(qiáng)度的增加而增大，說(shuō)明隨著離子強(qiáng)度的增加，肌球蛋白的表面疏水性增大，可能與鹽離子濃度升高導(dǎo)致蛋白表面疏水區(qū)域暴露[18]及不同離子強(qiáng)度下肌球蛋白分子的聚集狀態(tài)有關(guān)。隨著熱處理的進(jìn)行，低離子強(qiáng)度下的肌球蛋白分子明顯聚集，溶解度降低，可溶性肌球蛋白含量少，檢測(cè)到的ANS-S0值較小，甚至較熱處理前有降低趨勢(shì)；KCl濃度為150～300 mmol/L時(shí)，肌球蛋白的表面疏水性稍有增大，但無(wú)顯著差異(p>0.05)；但當(dāng)KCl濃度為600 mmol/L時(shí)，蛋白質(zhì)分子間疏水相互作用顯著增大(p<0.05)。結(jié)合肌球蛋白的溶解度變化結(jié)果分析，高鹽離子可以促進(jìn)肌球蛋白溶解[5]，更多的可溶性蛋白可以與探針結(jié)合，表面疏水性增大；經(jīng)熱處理后，肌球蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，分子結(jié)構(gòu)更加伸展，掩藏在肌球蛋白分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基逐漸暴露到分子表面[19]，可與ANS-S0結(jié)合的疏水區(qū)域作用位點(diǎn)增加，因此ANS-S0增大。

圖3 不同離子強(qiáng)度條件下熱處理過(guò)程中羅非魚(yú)肌球蛋白表面疏水性的變化Fig.3 Changes of surface hydrophobicity of tilapia myosin during heating process at various ionic strengths注：圖中大寫(xiě)A、B、C代表同一溫度下的顯著性差異；小寫(xiě)字母a、b、c代表同一離子強(qiáng)度下的顯著性差異。

2.4 不同離子強(qiáng)度條件下熱處理對(duì)肌球蛋白α-螺旋含量的影響

肌球蛋白由球狀頭部和桿狀尾部構(gòu)成，其中桿狀尾部是通過(guò)雙股α-螺旋纏繞而成[9]?？筛鶕?jù)圓二色譜圖中α-螺旋在208 nm 和222 nm 處的特征峰進(jìn)行分析(圖譜未列出)。結(jié)果如圖4所示，未經(jīng)熱處理的肌球蛋白分子α3螺旋含量隨著離子強(qiáng)度的升高而增大。鹽濃度的增加使肌球蛋白纖絲逐漸解聚，當(dāng)達(dá)到高離子強(qiáng)度600 mmol/L KCl時(shí)，肌球蛋白已經(jīng)完全解離成單體[3]，肌球蛋白的α-螺旋含量達(dá)到最大。但是隨著熱處理的進(jìn)行，蛋白分子發(fā)生劇烈熱運(yùn)動(dòng)，蛋白分子結(jié)構(gòu)伸展，螺旋結(jié)構(gòu)打開(kāi)，α-螺旋含量明顯下降(p<0.05)。在本實(shí)驗(yàn)中，升溫至40 ℃時(shí)，α-螺旋含量降低不顯著(p>0.05)；進(jìn)一步升溫到50 ℃時(shí)，α-螺旋含量出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)(p<0.05)；此后，溫度越高，α-螺旋含量越低。當(dāng)溫度逐漸達(dá)到80 ℃時(shí)，α-螺旋含量降至最低，此時(shí)蛋白質(zhì)變性程度最大，這也證實(shí)了熱處理是導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定的重要因素。并且高離子強(qiáng)度下的肌球蛋白α-螺旋含量較低離子強(qiáng)度下的變化程度較小，可能是因?yàn)棣?螺旋主要靠多肽鏈上的羰基(—CO)和氨基(—NH)之間的氫鍵所維持，此外靜電相互作用對(duì)它也有影響[20]，而高鹽離子的存在產(chǎn)生了靜電屏蔽效應(yīng)，減弱了電荷對(duì)氫鍵的影響[21]，二級(jí)結(jié)構(gòu)變化程度較小。因此，這也進(jìn)一步證實(shí)了高鹽對(duì)肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)有一定保護(hù)作用。

圖4 不同離子強(qiáng)度條件下熱處理過(guò)程中羅非魚(yú)肌球蛋白α-螺旋含量的變化Fig.4 Changes of α-helix content of tilapia myosin during heating processat various ionic strengths注：圖中大寫(xiě)A、B、C代表同一溫度下的顯著性差異；小寫(xiě)字母a、b、c代表同一離子強(qiáng)度下的顯著性差異。

2.5 不同離子強(qiáng)度條件下熱處理對(duì)肌球蛋白粒徑的影響

蛋白質(zhì)聚集具體表現(xiàn)為粒徑的增大，從動(dòng)態(tài)光散射的結(jié)果可直觀了解肌球蛋白聚集體的大小。溫度是引起蛋白質(zhì)聚集的主要因素，直接影響粒徑。結(jié)果如圖5所示，熱處理前，由于在較低的離子強(qiáng)度下，肌球蛋白呈細(xì)長(zhǎng)絲狀，溶液中顆粒較多，聚集成團(tuán)，溶解性差，粒徑較大；而隨著離子強(qiáng)度的升高，聚集的肌球蛋白經(jīng)歷先解聚再解離的過(guò)程，蛋白質(zhì)分子以單體形式存在[17]，蛋白溶解度逐漸增加，粒徑顯著減小(p<0.05)。熱處理后，在低離子強(qiáng)度1 mmol/L KCl下，肌球蛋白絲狀聚合物團(tuán)聚明顯，粒徑顯著增大(p<0.05)，但當(dāng)溫度進(jìn)一步升高，由于聚集體粒徑太大而發(fā)生沉降，導(dǎo)致其對(duì)光的散射減弱，使粒徑呈現(xiàn)微弱的下降趨勢(shì)；當(dāng)處理溫度達(dá)到60～70 ℃時(shí)，50～150 mmol/L KCl條件下的肌球蛋白溶液呈現(xiàn)顯著性變化(p<0.05)。而熱處理對(duì)離子強(qiáng)度300～600 mmol/L KCl下的肌球蛋白粒徑影響不明顯(p>0.05)。結(jié)合熱處理對(duì)肌球蛋白體系濁度和分子二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化分析，低鹽條件下的肌球蛋白以纖絲狀存在，穩(wěn)定性差，經(jīng)熱處理分子進(jìn)一步聚集沉淀，且溫度越高，形成的蛋白簇的粒徑也越大；而隨著鹽離子濃度升高，離子間的靜電吸引受到干擾，肌球蛋白纖絲解離，可溶性蛋白增多，溶解度增加，熱處理后分子三級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，分子間疏水作用增強(qiáng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，分子聚集，且高鹽(300～600 mmol/L KCl)離子的存在減弱了溫度對(duì)分子結(jié)構(gòu)的影響，導(dǎo)致其熱處理前后粒徑變化不明顯。

圖5 不同離子強(qiáng)度條件下熱處理過(guò)程中羅非魚(yú)肌球蛋白粒徑的變化Fig.5 Changes of particle size of tilapia myosin during heating process at various ionic strengths注：圖中大寫(xiě)A、B、C……代表同一溫度下的顯著性差異；小寫(xiě)字母a、b、c……代表同一離子強(qiáng)度下的顯著性差異。

3 結(jié)論

熱處理是一項(xiàng)基礎(chǔ)的加工工序，在水產(chǎn)食品加工中不可避免，而熱變性聚集引起的肌球蛋白功能特性的變化很大程度上限制了水產(chǎn)蛋白的應(yīng)用。肌球蛋白的高鹽溶特性也與當(dāng)今開(kāi)發(fā)“低鈉”食品的理念相悖。因此，改善肌球蛋白的溶解性和穩(wěn)定性成為了各國(guó)科學(xué)家最為關(guān)注的問(wèn)題之一。了解不同離子強(qiáng)度條件下肌球蛋白熱變性聚集行為及機(jī)制有助于為羅非魚(yú)資源的深加工提供理論依據(jù)，進(jìn)而擴(kuò)大水產(chǎn)蛋白的應(yīng)用范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熱處理對(duì)不同離子強(qiáng)度下肌球蛋白熱變性聚集的影響不完全相同。在低離子強(qiáng)度(1 mmol/L KCl)下，未經(jīng)熱處理的肌球蛋白分子聚集，體系渾濁，溶解度和表面疏水性較低；熱處理后的蛋白分子進(jìn)一步聚集，α-螺旋含量下降，且隨著熱處理溫度的升高聚集體粒徑迅速增大，體系明顯沉淀，溶解度下降，體系熱穩(wěn)定性極差；隨著離子強(qiáng)度的增加，肌球蛋白開(kāi)始解聚，溶解度逐漸增大，經(jīng)熱處理后的肌球蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子開(kāi)始聚集，粒徑增大；而在600 mmol/L KCl溶液中，肌球蛋白溶解性好，溶液澄清，熱處理后溶解度下降，α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，表面疏水性顯著增大，但與低離子強(qiáng)度下的變化相比，程度較小。綜合分析，高鹽條件下單體狀態(tài)的肌球蛋白分子經(jīng)熱處理后肽鏈展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露，而高離子強(qiáng)度所產(chǎn)生的靜電屏蔽效應(yīng)一定程度上保護(hù)了肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)，其變化程度較小，體系熱穩(wěn)定性較好。

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