金瑚，熊巍林，包李林，周青燕，鄒燕娣，林俞霞

(道道全糧油股份有限公司，國家油菜籽加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖南 岳陽，414000)

食用油脂在加工、貯存、使用過程中極易受到光、熱、酶、金屬離子等作用而發(fā)生氧化酸敗變質(zhì)，尤其是富含不飽和雙鍵的植物油更易發(fā)生氧化變質(zhì)。為防止食用油脂酸敗，產(chǎn)生對(duì)人體有害的物質(zhì)， 生產(chǎn)廠家會(huì)其加入抗氧化劑。目前常用的氧化劑主要有丁基羥基茴香醚(butyl-hydroxyanisd，BHA)、二丁基羥基甲苯(butylated-hydroxytoluene，BHT)、特丁基對(duì)苯二酚(tert-butylhydroquinone，TBHQ)、沒食子酸丙酯(propyl-gallate, PG)等，其中TBHQ的抗氧化性能是BHA、BHT、PG的2～5倍，且其熱穩(wěn)定性好，低毒，具有抑制細(xì)菌和霉毒作用，遇金屬離子不著色等諸多優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用在食用植物油中[1-3]。但是攝入過量TBHQ也會(huì)對(duì)人體造成傷害[4-5]，我國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 2760—2014)規(guī)定TBHQ使用的最大量為200 mg/kg。因此油脂中TBHQ應(yīng)該謹(jǐn)慎監(jiān)測(cè)。現(xiàn)行檢驗(yàn)方法主要采用氣相色譜法[6-8]、薄層色譜法[6]、比色法[6]和高效液相色譜法[10-22]。油樣的前處理大多采用溶劑提取法，而采用固相萃取的前處理較少。本實(shí)驗(yàn)采用硅膠作為吸附劑進(jìn)行萃取，利用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定TBHQ含量，為油脂中TBHQ含量的測(cè)定提供一種方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

硅膠(100～200 μm)，青島海洋化工；TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，滕州市天益工貿(mào)有限公司；甲醇(色譜純)，Sigma-Alorich;正己烷(分析純)，湖南匯虹試劑有限公司；二氯甲烷(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；不含TBHQ的葵花籽油，公司自給；洗脫液為A:100 mL正己烷/二氯甲烷混合液(體積比1∶1),B：50 mL二氯甲烷。

1.1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜(配有紫外檢測(cè)器)，安捷倫；RE-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；HGC-12A氮吹儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；玻璃層析柱d=1.2 cm，l=47 cm，帶砂芯配旋塞,上海宸喬生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜條件：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm)；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長為280 nm；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相C為甲醇，流動(dòng)相D為1%乙酸水溶液，梯度見表1。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的繪制和儀器檢出限

稱取0.1 g(精確至0.000 1 g)的TBHQ，用甲醇溶解并定量至100 mL，配制成1 mg/mL標(biāo)樣儲(chǔ)備液。取一定量的標(biāo)樣儲(chǔ)備液用甲醇分別稀釋配制成10、50、100、150、200、250 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液， 按照1.2.1

表1 流動(dòng)相洗脫梯度

中的液相色譜條件進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，其峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性方程如式(1)所示，R2=0.998 6，以儀器的S/N=3計(jì)算，測(cè)得儀器最低檢出限為1 mg/kg。

Y=20.84×C+34.6

(1)

式中：Y為峰面積；C為TBHQ質(zhì)量濃度，μg/mL。

A值的大小決定了定子內(nèi)圓單位表面積所產(chǎn)生的繞組銅損的大小，因而直接影響溫升和效率的高低。在定子鐵心內(nèi)徑確定的前提下，選擇不同的槽數(shù)可決定不同的A值， 電機(jī)定子槽數(shù)與電負(fù)荷的對(duì)

1.2.3 樣品的處理

向?qū)游鲋袧穹ㄑb入15.0 g硅膠，稱取0.1 g(精確至0.000 1 g)油樣，3～4 mL正己烷溶解上樣，待流完后棄去，加入100 mL A或50 mL B洗脫液，流速為1滴/s，用平底燒瓶收集洗脫液，旋蒸濃縮至近干，向平底燒瓶中加入石油醚清洗2次，每次1 mL，將清洗液轉(zhuǎn)移到 5 mL玻璃樣品瓶中，并在60 ℃的氮吹儀蒸發(fā)至干，加甲醇定容至1 mL，過0.45 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理探討

鑒于TBHQ和植物油的極性相差較大，而TBHQ屬于酸性類物質(zhì)，選用硅膠作為吸附劑，能滿足兩者的分離。能否準(zhǔn)確測(cè)定油中的TBHQ含量，跟硅膠量、油樣量、洗脫劑的極性和用量有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)以100 mg/kg葵花籽油為樣品，以測(cè)出該樣品的TBHQ含量和油脂凈化率高為目的來優(yōu)化前處理過程。

2.1.1 硅膠量的影響

固定100 mL洗脫液A或50 mL洗脫液B，油樣為0.1 g(TBHQ為10 μg)，流速為1滴/s。分別稱取10、15、20 g的硅膠進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)硅膠量為20 g時(shí)，使得少量的TBHQ殘留在硅膠柱內(nèi)沒有被洗脫出來；當(dāng)硅膠量為10 g時(shí)，樣品組分在硅膠內(nèi)未能進(jìn)行有效的固液動(dòng)態(tài)平衡分離，導(dǎo)致油脂沒被吸附就洗脫下來了；當(dāng)硅膠量為15 g時(shí)，TBHQ和油脂能較好地分離。

2.1.2 洗脫劑的選擇

固定硅膠量為15 g，油樣0.1 g(TBHQ為20 μg)，流速為1滴/s。鑒于目標(biāo)物TBHQ屬于較大的極性物質(zhì)，因而選擇洗脫劑為有一定極性的有機(jī)溶液。主要選擇了揮發(fā)性較小，較為常見且揮發(fā)性較小，毒性較小的有機(jī)溶劑為正己烷和二氯甲烷。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)證明：直接選用極性較大的二氯甲烷作為洗脫劑，TBHQ較易洗脫下來，但是需要控制洗脫劑的用量，否則，用量太大油脂也會(huì)一同洗脫下來。經(jīng)試驗(yàn)得知，單純使用二氯甲烷作為洗脫劑，且用量為50 mL可以滿足要求。當(dāng)使用正己烷和二氯甲烷混合液時(shí)，需要配制合適的極性才能較好的分離TBHQ和油脂。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，當(dāng)正己烷和二氯甲烷的體積比為1∶1時(shí)，100 mL混合洗脫液足以將20 μg的TBHQ洗脫下來。

2.1.3 洗脫流速的影響

固定硅膠量為15 g，100 mL洗脫液A或50 mL洗脫液B，油樣為0.1 g(TBHQ為10 μg)。流速過大，樣品的洗脫時(shí)間縮短，但是吸附到硅膠上的組分還沒來得及擴(kuò)散就隨著流動(dòng)相洗脫出去了，使得分離效果差。流速過慢，使得分離時(shí)間也較長，組分在硅膠柱內(nèi)的保留時(shí)間長，使得軸向擴(kuò)散增大，不利于組分分離，經(jīng)試驗(yàn)反復(fù)證明，流速為1滴/s可以較好地分離TBHQ和油脂。

2.1.4 油樣量的影響

固定硅膠量為15 g，100 mL洗脫液A或50 mL洗脫液B，流速為1滴/s。油樣量大，則更多油脂洗脫下來，油樣量小，若樣品的TBHQ含量少，則可能檢測(cè)不出來。經(jīng)試驗(yàn)證明，0.1 g的油樣量較為合適。

2.1.5 層析柱規(guī)格的影響

固定硅膠量為15 g，100 mL洗脫液A或50 mL洗脫液B，油樣為0.1 g(TBHQ為10 μg)，流速為1滴/s。分別選取內(nèi)徑分別為1.2 cm和2.0 cm的層析柱進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)證明：當(dāng)層析柱內(nèi)徑為2 cm時(shí)，上同樣量的硅膠，層析柱內(nèi)填充硅膠高度較矮，使得TBHQ和油脂分離不理想；而當(dāng)使用內(nèi)徑較小的層析柱時(shí)，硅膠高度較高，使分離效果較理想。

2.2 色譜分離條件

如圖1所示，樣品中的TBHQ與雜質(zhì)能較好地分開，雜質(zhì)峰不干擾測(cè)定。TBHQ的保留時(shí)間為6.227 min。將同一樣品在同一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次并取平均值計(jì)算儀器的精密度，測(cè)得變異系數(shù)RSD%為5.5%，說明儀器精密度良好。

圖1 樣品中TBHQ的色譜分離圖Fig.1 chromatographic separation figure of TBHQ in sample

2.3 方法的回收率和精密度

向不含TBHQ葵花籽油中添加TBHQ，配制濃度為500 mg/kg的儲(chǔ)備樣，繼續(xù)稀釋分別配制成60、100、250 mg/kg的標(biāo)樣，分別稱取少于0.1 g(精確至0.000 1 g)的3種標(biāo)樣，作為3個(gè)加標(biāo)水平，按照試驗(yàn)1.2.3樣品處理過程，每個(gè)加標(biāo)樣水平進(jìn)行3次平行測(cè)定，取平均值，計(jì)算3種方法的回收率和RSD%。測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 TBHQ含量的回收率

由表2可知, 方法回收率在95.6%～103.7%， RSD%在3.5%～5.1%，說明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

2.4 方法的最大萃取量

稱取含TBHQ為250 mg/kg的油樣0.1 g(精確至0.000 1 g)，按照1.2.3步驟處理油樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：100 mL的A洗脫液能洗脫21 μg TBHQ；50 mL的B洗脫液能洗脫16 μg TBHQ。

2.5 該方法測(cè)定結(jié)果與NY/T1602—2008農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的比較

由表3可知，該方法測(cè)出同一油樣的TBHQ含量基本與農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)一致。

表3 比對(duì)實(shí)驗(yàn)

2.6 樣品測(cè)定

對(duì)本公司葵花籽油中的TBHQ含量進(jìn)行抽檢6批次，利用A洗脫液和B洗脫液分別抽檢3批次，按照1.2.3的前處理過程進(jìn)行處理，其結(jié)果如表4所示。

表4 樣品中TBHQ含量

3 結(jié)論

采用硅膠作為吸附劑萃取植物油中TBHQ，利用反相液相色譜法測(cè)定其含量。本實(shí)驗(yàn)對(duì)硅膠的用量、油樣量、洗脫劑的極性、流速和層析柱規(guī)格進(jìn)行了優(yōu)化組合。優(yōu)化后的試驗(yàn)，其回收率在95.6%～103.7%， RSD%在3.5%～5.1%，同一樣品的TBHQ含量測(cè)定結(jié)果與NY/T1602—2008測(cè)定的基本一致，說明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，可用于植物油中TBHQ含量的測(cè)定。

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