蔡國(guó)強(qiáng)，陳雪峰，范華，劉歡，趙圓圓

( 陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安，710021)

發(fā)菜(Nostocflagelliforme)，學(xué)名發(fā)狀念珠藻，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的光能自養(yǎng)型陸生藍(lán)細(xì)菌。在我國(guó)，野生發(fā)菜主要分布在干旱、半干旱的荒漠及半荒漠地帶[1]。發(fā)菜胞外多糖是發(fā)菜生長(zhǎng)過(guò)程中分泌在細(xì)胞外的活性多糖，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、提高免疫力等生物活性，可以保護(hù)細(xì)胞，抵抗外界惡劣環(huán)境，賦予了發(fā)菜較高的食用和藥用價(jià)值[2-4]。然而，發(fā)菜因?yàn)樯L(zhǎng)緩慢和過(guò)度采掘致使野生發(fā)菜資源瀕臨毀滅。如何通過(guò)人工培養(yǎng)的方式提高發(fā)菜及其胞外多糖的產(chǎn)量成為亟待解決的問(wèn)題。王貴春等發(fā)現(xiàn)，在0.3 mol/L鹽濃度下，發(fā)菜胞外多糖產(chǎn)量較正常培養(yǎng)條件下提高了50.3%[5]。趙秀霞等對(duì)0 mol/L和0.3 mol/L鹽濃度下的發(fā)菜細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到13 170條差異表達(dá)基因，其中3 115條上調(diào)表達(dá)基因，10 055條下調(diào)，差異表達(dá)基因的GO功能聚類(lèi)和Pathway代謝通路分析表明，涉及到光合作用、糖酵解/糖合成、Na+/K+運(yùn)輸、能量代謝、核糖體代謝、次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成等眾多通路的基因都出現(xiàn)一定程度的差異表達(dá)[6]。GDP-甘露糖4,6-脫水酶是GDP-L-巖藻糖合成途徑中的關(guān)鍵酶，可以催化GDP-D-甘露糖形成GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖，進(jìn)而在GDP-酮-6-脫氧甘露糖3，5-表異構(gòu)酶的催化作用下，轉(zhuǎn)化成GDP-L-巖藻糖[7]。在從頭合成途徑中，GDP-甘露糖4,6-脫水酶參與合成活性核糖，為前體糖核苷酸的形成提供原料，從而參與多糖重復(fù)單元的合成組裝[8]。前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因在0.3 mol/L鹽濃度下轉(zhuǎn)錄水平較0 mol/L提高了2.18倍。

本研究對(duì)發(fā)菜中的GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建其重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中成功高效表達(dá)。為發(fā)菜多糖合成調(diào)控機(jī)理的研究奠定一定的理論基礎(chǔ),為GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因工程菌株的構(gòu)建提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用發(fā)菜、質(zhì)粒pET-28a由陜西科技大學(xué)微生物制造研究室保藏；大腸桿菌BL21、DH5α感受態(tài)細(xì)胞以及各種試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；pMD19T載體和各種限制性?xún)?nèi)切酶，TaKaRa寶生物工程有限公司；溴酚藍(lán)，沈陽(yáng)試三生化科技開(kāi)發(fā)有限公司；考馬斯亮藍(lán)，SDS和甘氨酸，美國(guó)Sigma公司；巰基乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；30% 丙烯酰胺和TEMED，碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYCZ-24EN蛋白電泳儀，江蘇興化市分析儀器廠；LDZX-30KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；MGC-400HP光照培養(yǎng)箱，上海善志儀器有限公司；2H-4水浴鍋，金壇宏華儀器廠；Mastercycler nexusPCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；DYY-2C瓊脂糖凝膠電泳儀，北京市六一儀器廠；FR-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)，上海復(fù)日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 目的片段TA克隆

按照天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組提取試劑盒方法提取發(fā)菜基因組DNA,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果及NCBI相似基因序列同源比對(duì)分析后進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上游引物的序列為G1：5′-ATGACGCAACAGAAGCGAGC-3′，下游引物的序列為G2：5′-TCAGAAGTGCAAAGCGCC-3′，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：發(fā)菜基因組DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR MasterMix 10 μL，ddH2O 6 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，46 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)并回收產(chǎn)物，與 pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)后送至北京奧科鼎盛生物科技公司測(cè)序。

1.3.2 序列分析

測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行確認(rèn)，通過(guò)DNAMAN推譯得到氨基酸序列，再使用DNAstar進(jìn)行分析。利用ProtScale分析目的蛋白的親水性和疏水性。利用 DNAMAN和SOPMA對(duì)GDP-甘露糖4,6-脫水酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用TMHMM對(duì)目的蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析。利用NetPhos3.1 Server對(duì)目的蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析。

1.3.3 GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因原核表達(dá)

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因的擴(kuò)增引物，并在上下游的5′端添加BamHI和XhoI的酶切位點(diǎn)以及相應(yīng)的保護(hù)堿基(A1:5′-CGCGGATCCATGACGCAACAGAAGCGAGC-3′;A2:5′-CCGCTCGAGGAAGTGCAAAGCGCC-3′)。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

以GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因與 pMD19-T連接而成的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將純化后的PCR產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒用BamHI和XhoI分別進(jìn)行雙酶切后相連，得到蛋白基因表達(dá)載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證。轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21，誘導(dǎo)表達(dá)后通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因TA克隆

提取發(fā)菜DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果符合預(yù)期大小(圖1)。PCR擴(kuò)增后，在1 100 bp位置出現(xiàn)條帶，符合預(yù)期(圖2)。將純化回收后的發(fā)菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因與pMD19-T相連，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果顯示，成功篩得含有大小為1 200 bp(含克隆位點(diǎn)140 bp左右)的重組克隆載體的陽(yáng)性菌株(圖3)，表明發(fā)菜GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因成功克隆至pMD19-T 載體上。

M-λDNA HindIII;1～2-發(fā)菜DNA圖1 發(fā)菜基因組DNA抽提電泳圖Fig.1 Electrophorogram of genome DNA from N.flagelliforme

M-DL2000；1-GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因圖2 GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 GDP-mannose 4,6-dehydratase PCR amplification

2.2 發(fā)菜GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因序列分析

通過(guò)pMD19-T通用引物對(duì)重組片段測(cè)序發(fā)現(xiàn)：發(fā)菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因大小為1 080 bp。使用DNAstar對(duì)其氨基酸序列表明：GDP-甘露糖4,6-脫水酶包含的氨基酸殘基數(shù)為359。 GDP-甘露糖4,6-脫水酶的帶電荷總氨基酸為84個(gè)，占總氨基酸殘基23.39% ，其中帶正電荷38個(gè)，帶負(fù)電分析荷46個(gè)。極性氨基酸共有100個(gè)，占27. 86% ，疏水氨基酸有119個(gè)，占33. 15% ，酸性氨基酸和堿性氨基酸分別占12.53%和10.58%。在GDP-甘露糖4,6-脫水酶中包含較多的氨基酸為L(zhǎng)eu(9.19%)、Gly(7.52%)、Thr(6.96%)、Arg(6.69%)、Glu(6.41%)、Ala(6.41%)、Asp(6.13%)、Gln(5.85%)、Tyr(5.85%)(圖4)。

M-DL2000；1～3-GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因陽(yáng)性轉(zhuǎn)子圖3 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(DH5α)的PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR identification of positive transformant (DH5α)

圖4 GDP-甘露糖4,6-脫水酶的核苷酸及氨基酸序列 Fig.4 Nucleotide sequence and amino acid sequence of GDP-mannose 4,6-dehydratase

通過(guò)DNAMAN軟件將發(fā)菜中GDP-甘露糖4,6-脫水酶的核苷酸序列及氨基酸序列與GenBank的同源物種序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因具有較高的保守性，與點(diǎn)狀念珠藻(NostocpunctiformePCC 73102)的基因同源性達(dá)93.1%，氨基酸同源性達(dá)97.3%。與絲狀藍(lán)藻(Calothrixsp. PCC 7507)的基因同源性達(dá)83.3%，氨基酸同源性達(dá)92.4%。與筒孢藻(CylindrospermumstagnalePCC 7417)的基因同源性為83.1%，氨基酸同源性達(dá)91.2%。與念珠藻(Nostocsp. PCC 7107)的基因同源性為82.64%，氨基酸同源性達(dá)93.13%。與NostocpiscimakeCENA21的基因同源性為81.43%，氨基酸同源性達(dá)91.12%。與魚(yú)腥藻(AnabaenacylindricaPCC 7122)的基因同源性為80.87%，氨基酸同源性達(dá)90.58%。與側(cè)生藻(Fischerellasp. NIES 3754)的基因同源性為79.39%，氨基酸同源性達(dá)88.72%。與多變魚(yú)腥藻(AnabaenavariabilisATCC 29413)的基因同源性為78.0%，氨基酸同源性達(dá)89.0%(圖5)。

2.3 GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因的疏水性、跨膜區(qū)、磷酸化位點(diǎn)分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用ExPASy軟件對(duì)發(fā)菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶的氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析，結(jié)果顯示第194位的脯氨酸(Pro)親水性最強(qiáng)，第185位的天冬酰胺(Asnr)疏水性最強(qiáng)。整體來(lái)看，親水性區(qū)間分布更廣，相對(duì)于疏水性區(qū)間較多，因此確定GDP-甘露糖4,6-脫水酶是親水性蛋白。

利用TMHMM程序?qū)DP-甘露糖4,6-脫水酶進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明，GDP-甘露糖4,6-脫水酶不含跨膜區(qū)。

利用NetPhos對(duì)GDP-甘露糖4,6-脫水酶的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，GDP-甘露糖4,6-脫水酶的Ser、Thr和Tyr磷酸化位點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為：17、15和13個(gè)。運(yùn)用DNAMAN軟件和SOPMA軟件對(duì)GDP-甘露糖4,6-脫水酶二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，雖然不同軟件的算法存在差異，但經(jīng)綜合分析認(rèn)為，發(fā)菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要構(gòu)成方式為α螺旋和隨機(jī)卷曲(表1)。

圖5 GDP-甘露糖 4,6-脫水酶DNA 的核苷酸序列(左)及推導(dǎo)的氨基酸序列(右) 同源樹(shù)Fig.5 Homology tree of nucleotide sequence (left) and its deduced amino acid sequence (right) of GDP-mannose 4,6-dehydratase

表1 發(fā)菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

Table 1 The secondary structure prediction of GDP-mannose 4,6-dehydratase from N. fiagelliforme

分析方法α螺旋β折疊轉(zhuǎn)角隨機(jī)卷曲DNAMAN69(19.22%)84(23.40%)0206(57.38%)SOPMA140(39.0%)58(16.16%)0161(44.84%)

2.4 GDP-甘露糖4,6-脫水酶在大腸桿菌中的表達(dá)

構(gòu)建GDP-甘露糖4,6-脫水酶的表達(dá)載體pET28a-GDP-mannose 4,6-dehydratase,轉(zhuǎn)化DH5α挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，得到1 300 bp大小的特異性條帶(加上克隆位點(diǎn)300 bp左右)，符合預(yù)期大小(圖5)。抽取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果在1 080 bp處出現(xiàn)1條特異條帶，與預(yù)期片段大小一致(圖6)。測(cè)序結(jié)果表明插入的片段就是GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因。

M-DL2000；1～3-GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因重組質(zhì)粒陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子圖5 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(DH5α/pET28a-GDP-mannose 4,6-dehydratase)的PCR驗(yàn)證Fig.5 PCR identification of positive transformant(DH5α/pET28a-GDP-mannose 4,6-dehydratase)

1-DL2000；2-雙酶切后GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因；3-重組質(zhì)粒雙酶切；4-雙酶切后pET28a；5-10 kb DNA ladder圖6 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(DH5α/pET28a-GDP-mannose 4,6-dehydratase)的酶切驗(yàn)證Fig.6 Dual restriction enzyme digestion identification of positive transformant (DH5α/pET28a-GDP-mannose 4,6-dehydratase)

將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21，篩選陽(yáng)性菌接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD值為0.8時(shí)，加入IPTG使其濃度為1 mmol/L，16 ℃，120 r/min培養(yǎng)20 h后取樣進(jìn)行電泳。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明有外源蛋白表達(dá)(圖7)，參照蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，外源蛋白分子質(zhì)量約為41.08 ku，與預(yù)測(cè)的GDP-甘露糖4,6-脫水酶分子質(zhì)量相同。

M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-IPTG誘導(dǎo)的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子； 2-未誘導(dǎo)的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子；3-IPTG誘導(dǎo)10 h的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子；4-IPTG誘導(dǎo)15 h的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子；5-IPTG誘導(dǎo) 20 h的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子圖7 GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因在大腸桿菌BL21中的表達(dá)Fig.7 GDP-mannose 4,6-dehydratase expressed in E.coli BL21

3 討論

由于發(fā)菜全基因組尚未公布，因此通過(guò)BLAST比對(duì)高同源性的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行克隆成為研究發(fā)菜基因的主要手段[9-10]。所以根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果及同源比對(duì)分析設(shè)計(jì)引物進(jìn)行GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因的克隆，成功得到大小為1 080 bp的目的序列。經(jīng)同源性比較發(fā)現(xiàn)發(fā)菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因具有較高保守性，與點(diǎn)狀念珠藻(NostocpunctiformePCC 73 102)的核苷酸序列相似度達(dá)93.1%，氨基酸序列相似度達(dá)97.3%。生物信息學(xué)分析表明GDP-甘露糖4,6-脫水酶是親水性膜外蛋白，酪氨酸有13個(gè)磷酸化位點(diǎn)，蘇氨酸有15個(gè)磷酸化位點(diǎn)，絲氨酸有17個(gè)磷酸化位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要構(gòu)成方式為隨機(jī)卷曲和α螺旋，等電點(diǎn)為5.73，正負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)分別為38和46。這為進(jìn)一步研究GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因在發(fā)菜多糖代謝中的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。此外，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因的高效表達(dá)載體，這為今后GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因工程菌株的構(gòu)建提供理論依據(jù)。

鹽脅迫下發(fā)菜多糖產(chǎn)量提高，GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。這暗示基因可能是鹽脅迫下發(fā)菜胞外多糖代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，它們?cè)诎l(fā)菜響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。GDP-甘露糖4,6-脫水酶可以催化GDP-D-甘露糖形成GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖，進(jìn)而形成GDP-L-巖藻糖，參與多糖合成。說(shuō)明發(fā)菜可能通過(guò)相關(guān)基因調(diào)控多糖合成途徑以響應(yīng)鹽脅迫，這也從分子層面為“鹽脅迫下發(fā)菜多糖產(chǎn)量明顯提高”這一結(jié)論提供依據(jù)。然而，多糖代謝調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的生物調(diào)控過(guò)程，參與基因眾多，它們?nèi)绾卧谵D(zhuǎn)錄水平調(diào)控多糖代謝以響應(yīng)鹽脅迫還需要進(jìn)一步研究。

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