張保榮

畢茹茹

顧 兵

(1徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2 宿遷市第一人民醫(yī)院，江蘇 宿遷 223899；3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221002)

腸桿菌科細(xì)菌是醫(yī)院和社區(qū)感染最常見的病原菌，可引起多部位炎癥，如肺炎、泌尿系統(tǒng)炎癥、敗血癥、腹膜炎、醫(yī)療器械相關(guān)性感染等。由于幾乎可水解所有頭孢菌素的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)在腸桿菌科細(xì)菌中的流行，對于重癥感染患者，碳青霉烯類作為最有效的抗菌藥物被廣泛使用。隨著碳青霉烯類藥物消耗量的增加，耐藥菌株開始出現(xiàn)，并在全球范圍快速傳播[1-2]。耐碳青霉烯腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)通常表現(xiàn)對β-內(nèi)酰胺類藥物高水平抵抗，同時(shí)伴隨著對多種其他抗菌藥物，如氨基糖苷類、氟喹諾酮類等耐藥，使治療成為十分棘手的問題。

CRE的耐藥機(jī)制主要包括產(chǎn)生各種類型碳青霉烯酶、膜孔蛋白缺失或突變聯(lián)合ESBLs或頭孢菌素酶(AmpC)的高水平產(chǎn)生、外排泵的過度表達(dá)等[3]，其中產(chǎn)生碳青霉烯酶是最常見的耐藥機(jī)制，也是對公共健康威脅最大的因素。碳青霉烯酶屬于β-內(nèi)酰胺酶家族，能夠水解包括頭孢菌素及碳青霉烯在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類藥物。基于分子特征的不同，目前已知的碳青霉烯酶分別屬于Ambler分類中的A、B及D類，A類碳青霉烯酶活性部位有絲氨酸結(jié)構(gòu)，主要包括KPC、GES、IMI、SME和SFC，能水解青霉素類、頭孢菌素、氨曲南和碳青霉烯類抗生素，活性可被克拉維酸、他唑巴坦抑制；B類屬于金屬酶，活性部位有鋅離子，主要包括 IMP、VIM、SPM、NDM、GIM和SIM，活性不受β-內(nèi)酰胺酶抑制劑影響，可被EDTA等金屬螯合劑所抑制，不能水解氨曲南；D類主要為OXA-48-like酶，能水解青霉素類、鄰氯西林、苯唑西林等藥物。

編碼碳青霉烯酶的基因通常存在于可移動基因元件上，通過質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座子容易在細(xì)菌之間水平傳播，導(dǎo)致局部流行，甚至是感染暴發(fā)[3]；同時(shí)，產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌感染常伴隨治療的失敗及高病死率。因此，快速、準(zhǔn)確地識別產(chǎn)酶菌株，對于患者的治療及采取合適的感染控制措施，防止耐藥基因的播散具有重要意義。盡管臨床實(shí)驗(yàn)室可以常規(guī)進(jìn)行碳青霉烯類抗菌藥物的敏感性檢測，但是敏感性下降并不一定是由于產(chǎn)生了碳青霉烯酶。分子診斷技術(shù)是判斷細(xì)菌是否產(chǎn)生碳青霉烯酶的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢測方法不僅步驟繁瑣，而且需要特殊的儀器設(shè)備，在臨床工作中難以廣泛開展。另外，分子診斷僅能夠?qū)σ阎愋偷拿富驒z測，對于少見的類型存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)。近年來，多種碳青霉烯酶表型檢測方法被廣泛應(yīng)用，每種方法都各具特色。本文對腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶表型檢測方法進(jìn)行綜述，目的是通過表型檢測能簡便、準(zhǔn)確、及時(shí)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶株，為患者的治療及控制耐藥菌株的傳播提供幫助。

1表型篩查試驗(yàn)

1.1 藥物敏感試驗(yàn) 產(chǎn)生碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌(carbapenemase-producing Enterobacteriaceae CPE)通常表現(xiàn)對一種或多種碳青霉烯類藥物敏感性下降。藥物敏感性檢測方法主要為最低抑菌濃度(MIC)測定及紙片擴(kuò)散法測量抑菌環(huán)直徑，當(dāng)MIC值升高或抑菌環(huán)直徑縮小提示為可疑的CPE菌株。有報(bào)道指出不同的碳青霉烯藥物對CPE的篩選能力存在差異，厄他培南敏感性較高，但特異性略差，亞胺培南情況類似，美羅培南在敏感性和特異性的綜合評價(jià)中有較滿意的結(jié)果[4]。Benenson等[5]利用紙片擴(kuò)散法檢測腸桿菌科細(xì)菌對亞胺培南的敏感性，判斷是否產(chǎn)生KPC酶，靈敏度和特異度分別為100%、96%。有研究應(yīng)用VITEK 2測定亞胺培南與美羅培南的MIC進(jìn)行CPE篩選，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合應(yīng)用可以顯著提高檢測能力[6]。

判斷CPE的折點(diǎn)目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，Tamma等[7]通過對198株CRE進(jìn)行耐藥基因及碳青霉烯類藥物MIC檢測，發(fā)現(xiàn)CPE菌株與非CPE菌株的MIC值分布存在差異，不同基因型的碳青霉烯酶MIC分布無差異。研究[7]認(rèn)為，篩查CPE的最佳厄他培南濃度為0.5 μg/mL，美羅培南、亞胺培南、多利培南的濃度為2 μg/mL。Pasteran等[6]發(fā)現(xiàn)，以亞胺培南MIC≥2 μg/mL聯(lián)合美羅培南MIC≥1 μg/mL作為CPE判斷標(biāo)準(zhǔn)，具有很高的靈敏度及特異度。也有學(xué)者在CPE低流行區(qū)域進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示以目前美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)敏感標(biāo)準(zhǔn)(美羅培南MIC≤1 μg/mL),14%的CPE菌株對美羅培南敏感，以歐洲抗菌藥物敏感試驗(yàn)委員會(EUCAST)敏感標(biāo)準(zhǔn)(美羅培南MIC≤2 μg/mL)，此比率上升至20%，認(rèn)為以美羅培南篩查CPE時(shí)，應(yīng)采用的折點(diǎn)為MIC 0.12 μg/mL[8]。

藥物敏感試驗(yàn)可以方便、快捷地進(jìn)行CPE篩查，同時(shí)可以根據(jù)藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥。但由于其他的耐藥機(jī)制，如膜孔蛋白缺失合并高產(chǎn)AmpC酶同樣可導(dǎo)致碳青霉烯藥物MIC值升高或抑菌環(huán)直徑縮小，有些產(chǎn)酶菌株對碳青霉烯類藥物水解能力弱，也可出現(xiàn)敏感結(jié)果。因此，產(chǎn)酶株與非產(chǎn)酶株藥敏結(jié)果會出現(xiàn)部分重疊。

1.2 篩選培養(yǎng)基 主要有添加了碳青霉烯類藥物的麥康凱培養(yǎng)基及商業(yè)化的顯色培養(yǎng)基，可以直接從臨床標(biāo)本中篩選出耐藥菌株。利用CPE對碳青霉烯抗生素敏感性下降的特性，以及麥康凱培養(yǎng)基能有效抑制革蘭陽性菌的生長，改進(jìn)后的麥康凱具有很好的選擇作用。在麥康凱培養(yǎng)基中加入1 μg/mL亞胺培南用于直腸拭子篩選CPE菌株有很好的檢測效能[9]。商業(yè)化的顯色培養(yǎng)基具有篩選和鑒定雙重作用，其中的抑制劑限制了雜菌的生長，未受影響的細(xì)菌在生長過程中代謝產(chǎn)生的酶，水解培養(yǎng)基中底物，釋放色原物質(zhì)呈現(xiàn)特定顏色，利用顏色的不同對目標(biāo)菌進(jìn)行鑒定。Panagea等[10]使用CHROMager KPC培養(yǎng)基監(jiān)測直腸拭子標(biāo)本中CPE，陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值分別為100%、98.8%，但對于產(chǎn)KPC和VIM酶的菌株通過顏色判斷或菌落特征并不能區(qū)別。早期的顯色培養(yǎng)基具有方便、特異度高、結(jié)果易于觀察的優(yōu)點(diǎn)，不過主要用于篩選CRE，對CPE無特異性，并且對一些低水平耐藥的CPE菌株，敏感性較低，易出現(xiàn)漏檢。

ChromID CARBA是一種新型顯色培養(yǎng)基，專為CPE設(shè)計(jì)，添加劑中含有特異性抑制革蘭陽性菌和非產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌的成分。Perry 等[11]比較ChromID CARBA和Colorex KPC兩種培養(yǎng)基檢測產(chǎn)NDM-1酶腸桿菌科細(xì)菌的能力，認(rèn)為前者更敏感，可以檢測出美羅培南MIC低于2 μg/mL的菌株。另外一種新型的篩選培養(yǎng)基SUPERCARBA，其中加入一種碳青霉烯類藥物、氯唑西林、硫酸鋅，可以篩選多種類型碳青霉烯酶，如OXA-48、NDM、VIM、IMP、KPC等，檢測靈敏度在95%以上[12]。

利用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行臨床標(biāo)本中CPE的篩查是一種好方法，最大優(yōu)勢在于能從多種菌群中分離出目標(biāo)菌，但是孵育過程需24～48 h，不能滿足快速檢測要求，并且不能區(qū)分碳青霉烯酶類型。

2表型確認(rèn)試驗(yàn)

2.1 抑制劑增效試驗(yàn) 不同類型的碳青霉烯酶活性可被相應(yīng)的抑制劑所抑制，在碳青霉烯類藥物中加入酶抑制劑，可以使藥物的MIC下降或紙片擴(kuò)散法的抑菌環(huán)增大。常用的方法有E-test和紙片增效試驗(yàn)，前者判讀標(biāo)準(zhǔn)為加酶抑制劑一側(cè)與另一側(cè)比較MIC值相差8倍以上是陽性，后者可以將抑制劑直接加到藥物紙片中，與原藥物紙片比較抑菌環(huán)的大小，或者將抑制劑紙片貼在藥物紙片附近，觀察兩者是否出現(xiàn)協(xié)同。A類酶抑制劑有硼酸類化合物、克拉維酸等，有文獻(xiàn)評價(jià)兩種抑制劑對產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌檢測能力，硼酸檢出所有產(chǎn)酶株，而克拉維酸靈敏度及特異度稍差[13]。硼酸類除了能抑制A類β-內(nèi)酰胺酶，也能抑制AmpC酶，當(dāng)菌株高產(chǎn)AmpC酶伴隨膜蛋白缺失時(shí)易造成假陽性，若聯(lián)合加入氯唑西林，因其僅抑制AmpC酶可以進(jìn)行鑒別。B類酶抑制劑常用的有EDTA、吡啶二羧酸，兩者對于金屬酶的檢測均有很好的效果。Tsakris等[14]報(bào)道以紙片增效試驗(yàn)檢測同時(shí)具有KPC和金屬酶的菌株，當(dāng)美羅培南紙片中僅加入苯硼酸或EDTA一種時(shí)，結(jié)果均為陰性，只有兩者同時(shí)加入才出現(xiàn)陽性結(jié)果。OXA-48目前無理想的特異性抑制劑，但是可利用其水解替莫西林的特征進(jìn)行識別。有研究者分別使用苯硼酸、吡啶二羧酸和氯唑西林作為A、B類及AmpC酶抑制劑，聯(lián)合替莫西林紙片擴(kuò)散法檢測腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶，結(jié)果顯示所有OXA-48菌株與苯硼酸和吡啶二羧酸均無協(xié)同作用，并且替莫西林抑菌環(huán)<10 mm，以此作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度及特異度均達(dá)100%[15]。

抑菌劑增效試驗(yàn)操作簡單，結(jié)果易于觀察，可區(qū)分碳青霉烯酶類型。但是，當(dāng)以EDTA作為金屬酶抑制劑時(shí)，有些菌株本身對EDTA敏感可出現(xiàn)假陽性，并且檢測過程需16～20 h的孵育，無法快速獲得結(jié)果。

2.2 改良Hodge試驗(yàn)(modified Hodge test,MHT) Hodge試驗(yàn)最早用于淋病奈瑟菌產(chǎn)生青霉素酶的檢測，后來Lee等[16]進(jìn)行改進(jìn)用于銅綠假單胞菌和不動桿菌的金屬酶篩查。2009年CLSI建議對碳青霉烯類藥物敏感性下降的腸桿菌科細(xì)菌采用MHT進(jìn)行碳青霉烯酶的表型確證。MHT原理基于產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌使碳青霉烯藥物失活，大腸埃希菌(ATCC 25922)作為對藥物敏感的指示菌，在試驗(yàn)菌株接種線與抑菌環(huán)相交處出現(xiàn)增強(qiáng)生長。MHT步驟簡單，不需要特殊的試劑和儀器，適合于各級實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展，并且對于A類和D類碳青霉烯酶顯示較好的檢測能力，但是對于金屬酶，如NDM、VIM、IMP的檢測存在缺陷。一些菌株由于ESBLs或者存在高水平AmpC，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果[17]。

針對MHT的不足，研究人員進(jìn)行了多種改進(jìn)。有文獻(xiàn)報(bào)道[18]以間接碳青霉烯酶試驗(yàn)檢測KPC酶，試驗(yàn)步驟類似于MHT，藥敏紙片為亞胺培南，試驗(yàn)菌株不是沿藥敏紙片邊緣劃線，而是涂在EDTA紙片上，貼在亞胺培南紙片邊緣，孵育過夜后觀察結(jié)果，指示菌在EDTA邊緣出現(xiàn)凹陷生長為陽性。EDTA在其中作用是裂解菌體細(xì)胞，釋放KPC酶，提高了檢測能力。對于金屬酶檢測的缺陷，有研究嘗試在培養(yǎng)基中加入硫酸鋅，檢測NDM的靈敏度從50%增高至85.7%，但特異度無改善[19]。最近研究[20]發(fā)現(xiàn)，NDM是結(jié)合在外膜上的脂蛋白；Pasteran等[21]通過在MH培養(yǎng)基中加入非離子表面活性劑Triton X-100，使MHT檢測NDM的靈敏度>90%。Takayama等[22]報(bào)道在MH培養(yǎng)基中加入氯唑西林進(jìn)行MHT，AmpC導(dǎo)致的假陽性被有效控制。也有研究以麥康凱培養(yǎng)基代替MH，敏感性明顯提高，可能是麥康凱中的抑制物如膽鹽增加了胞內(nèi)酶的釋放[23]。

2.3 Carba NP試驗(yàn) 2012年Nordmann等[24]報(bào)道了一種新型的快速檢測細(xì)菌水解亞胺培南能力的試驗(yàn)，稱為Carba NP，試驗(yàn)原理基于生化顯色。碳青霉烯酶能水解亞胺培南的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使溶液pH下降，其中的酚紅指示劑顏色發(fā)生紅色到黃色的改變。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程僅需要2 h，縮短了檢測時(shí)間，能早期識別CPE菌株。2015年CLSI推薦Carba NP作為腸桿菌科細(xì)菌、銅綠假單胞菌和不動桿菌屬產(chǎn)生碳青霉烯酶的表型確證試驗(yàn)[24]。據(jù)報(bào)道本試驗(yàn)有高特異性，對于KPC酶及金屬酶的檢測有高靈敏度，但是對于OXA-48-like的敏感性報(bào)道不一，11%～100%[24-26]。Segawa等[27]以此試驗(yàn)檢測IMP-6及IMP-1型酶，發(fā)現(xiàn)陽性出現(xiàn)時(shí)間與酶基因的表達(dá)水平顯著相關(guān)，提示Carba NP有潛力用于評價(jià)碳青霉烯酶基因的表達(dá)程度。

盡管Carba NP簡單快速，但是影響因素較多，如配制試驗(yàn)溶液pH、待測菌分離選用的培養(yǎng)基、接種量、孵育時(shí)間、結(jié)果判定的主觀因素、黏液型的表型以及酶活性表達(dá)水平等均會對結(jié)果造成影響[26,28]。另外，試驗(yàn)需要一些特殊的試劑，如商品化蛋白提取液(B-PER II)、亞胺培南標(biāo)準(zhǔn)品粉劑等，不僅試驗(yàn)成本較高，而且亞胺培南粉劑加入后試劑要盡快使用，有效期僅3 d，限制了該試驗(yàn)的推廣應(yīng)用?，F(xiàn)在一些商品化的試劑盒應(yīng)運(yùn)而生，如Rapidec Carba NP、Rosco Neo-Rapid Carb Kit等，據(jù)報(bào)道上述商品化產(chǎn)品具有同樣的檢測性能，操作更簡便[29-30]。Pires等[31]介紹了一種替代試驗(yàn)(Blue-Carba)，不需要蛋白提取液，直接從培養(yǎng)基取菌使用，以靜脈滴注使用的亞胺培南/西司他丁代替亞胺培南標(biāo)準(zhǔn)品，選擇溴麝香草酚藍(lán)作為指示劑替代酚紅。據(jù)描述Blue-Carba具有很高的檢測能力，而且減少了試劑花費(fèi)，簡化了試驗(yàn)操作，同時(shí)因?yàn)殇鬻晗悴莘铀{(lán)變色范圍在pH 6.0～7.6，覆蓋了大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶(pH 6.8)，水解后引起的顏色變化更明顯。也有文獻(xiàn)[32]報(bào)道以Triton X-100代替蛋白提取液，亞胺培南/西司他丁代替亞胺培南標(biāo)準(zhǔn)品，同樣取得了滿意的結(jié)果。有研究[33]對此方法進(jìn)行改進(jìn)，將配制好的亞胺培南酚紅混合溶液及單一酚紅溶液(作為對照)分別滴加在濾紙條上，然后取培養(yǎng)基上的菌落直接涂在濾紙上，5 min內(nèi)根據(jù)顏色變化判讀結(jié)果，也取得了理想效果，方便、快速、直觀的方法更易被臨床實(shí)驗(yàn)室所接受。

2.4 碳青霉烯滅活試驗(yàn)(carbapenem inactivation method，CIM) CIM 2015年由荷蘭van der Zwaluw研究團(tuán)隊(duì)首次提出，可以在8 h內(nèi)檢測革蘭陰性桿菌的碳青霉烯酶，對KPC、NDM、OXA-48、VIM、IMP 和 OXA-23型β-內(nèi)酰胺酶的檢測結(jié)果與PCR具有高度一致性[34]。操作如下：(1)取一滿環(huán)血平板或MH上菌株加入實(shí)驗(yàn)室用水中，做成均勻菌懸液，夾一片10 μg美羅培南藥敏紙片浸入菌懸液，35℃孵育2 h；(2)大腸埃希菌(ATCC 25922)以生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?，按照常?guī)紙片擴(kuò)散法操作涂布于MH平板表面；(3)取出美羅培南紙片貼在已涂布大腸埃希菌的MH平板上，35℃至少孵育6 h或過夜判讀結(jié)果。如果待檢菌株產(chǎn)生碳青霉烯酶，作用于藥敏紙片中的美羅培南使其失去活性，指示菌的生長就不受影響，反之指示菌生長被抑制，在美羅培南周圍出現(xiàn)明顯抑菌圈。對203株碳青霉烯耐藥的革蘭陰性桿菌進(jìn)行CIM和Carba NP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與多重PCR比較，CIM靈敏度和特異度分別為95.7%、95.5%，而CarbaNP分別為75.0%、99.1%[35]。2017年CLSI 推薦了改良CIM試驗(yàn)(mCIM)用于腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生碳青霉烯酶的表型確認(rèn)試驗(yàn)[36]，mCIM與CIM的區(qū)別在于菌懸液使用胰蛋白酶大豆肉湯代替實(shí)驗(yàn)室用水制備，加入美羅培南紙片后孵育時(shí)間從2 h延長至4 h。Pierce等[37]對mCIM進(jìn)行評價(jià)，認(rèn)為該試驗(yàn)不僅操作簡單，而且結(jié)果易于判斷、重現(xiàn)性好。

CIM試驗(yàn)試劑花費(fèi)少，容易操作，結(jié)果判斷明確，檢測OXA-48-like靈敏度高[35,37]，但試驗(yàn)需孵育2次，第一次2～4 h，第二次至少6 h或過夜，操作時(shí)間長，不能達(dá)到快速檢測的目的，另外當(dāng)酶活性較低時(shí)會出現(xiàn)假陰性結(jié)果[38]。

2.5 其他表型確認(rèn)試驗(yàn) 以抗體介導(dǎo)為基礎(chǔ)的免疫層析方法開始應(yīng)用于檢測碳青霉烯酶，表現(xiàn)了良好的性能，尤其對于OXA-48-like的檢測有一定的優(yōu)勢。攜帶OXA-48-like酶的菌株常表現(xiàn)為對碳青霉烯類藥物的低MIC值，并且不同于KPC 和金屬酶，OXA-48-like缺乏用于表型檢測所需的特異性抑制劑，在常規(guī)檢驗(yàn)中易造成漏檢。一種商品化的產(chǎn)品OXA-48 K-SeT檢測OXA-48-like的靈敏度和特異度均達(dá)100%[39]。試驗(yàn)原理基于抗體捕獲OXA-48酶的兩個(gè)特異性抗原表位，將其中之一的特異性抗體以條帶狀固定在硝酸纖維膜上，膠體金標(biāo)記另一抗體吸附在結(jié)合墊上。當(dāng)待檢樣品加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記抗體后發(fā)生特異性結(jié)合，再移動至固化抗體區(qū)域時(shí)又發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色條帶。捕獲抗體可以結(jié)合目前已知的多種OXA-48-like變異體，如OXA-48、OXA-162、OXA-181、OXA-204、OXA-232和OXA -244等，15 min內(nèi)獲得結(jié)果。最近報(bào)道了一種新型多通道免疫層析試劑OKN K-SeT，可以同時(shí)檢測OXA-48、KPC、NDM，對于含有目標(biāo)酶的菌株均能正確檢出，非CPE或產(chǎn)生其他類型碳青霉烯酶菌株無交叉反應(yīng)，表現(xiàn)高效的檢測性能[40]。免疫層析分析操作簡單，結(jié)果快速、準(zhǔn)確，敏感性高，不需要其他附加的試劑和儀器，易于在臨床實(shí)驗(yàn)室開展，并且檢測限在106CFU/mL，有希望直接從尿或其他生物樣本中進(jìn)行檢測,但是因?yàn)閷儆谏唐坊噭噭┗ㄙM(fèi)較多，并且只能對目標(biāo)酶型進(jìn)行檢測，存在局限性。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS)是一種軟電離技術(shù)，將樣品分散在基質(zhì)中，在激光照射下分子電離，電離的樣品在電場作用下飛過真空的飛行管，通過離子的質(zhì)量電荷之比與離子的飛行時(shí)間成正比分析離子，測得樣品分子的分子量達(dá)到鑒定目的。MALDI-TOF/MS通常用于疾病的診斷和藥物代謝研究，近年來在微生物的鑒定方面應(yīng)用較多，對于耐藥機(jī)制檢測方面也有很大潛能。Hrabák等[41]描述了以質(zhì)譜方法檢測腸桿菌科細(xì)菌及銅綠假單胞菌產(chǎn)酶引起的碳青霉烯類藥物耐藥，美羅培南溶液與細(xì)菌培養(yǎng)物混合后35℃孵育3 h，混合液離心，上清液用于質(zhì)譜分析，以美羅培南及其鈉鹽特征峰的出現(xiàn)與否判斷結(jié)果，方法的靈敏度和特異度分別為96.67%、97.87%。該方法簡便快速、高通量、低成本、可信度高，除了用于細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測，還可以直接從血培養(yǎng)中測定，節(jié)省了時(shí)間，對KPC、VIM、NDM、IMP、OXA-48-like均有很高的檢出能力[42]。但是質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，普通微生物實(shí)驗(yàn)室難以配置，并且不能區(qū)分碳青霉烯酶類型，對于流行病學(xué)調(diào)查的作用有限。

3總結(jié)與展望

細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為全球化的問題，特別是CPE引起的感染，由于其高傳播性及高病死率，應(yīng)引起臨床及感控人員的高度重視。準(zhǔn)確、及時(shí)發(fā)現(xiàn)CPE菌株，對于患者的治療及感控措施的實(shí)施至關(guān)重要。不同的檢測方法對不同類型碳青霉烯酶存在檢測能力上的差異，截至目前，仍缺乏一種完美檢測手段，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己的條件及地區(qū)流行情況進(jìn)行選擇。

顯色培養(yǎng)基可以從臨床標(biāo)本中直觀地分離出產(chǎn)酶菌株，在去定植檢測中有很好的應(yīng)用前景。免疫層析法對KPC、NDM、OXA-48等常見類型可以在15 min得出結(jié)果，當(dāng)懷疑由相關(guān)機(jī)制引起的感染暴發(fā)時(shí)，該法是不錯的選擇。MALDI-TOF/MS作為新型的檢測手段開始用于細(xì)菌耐藥方面的研究，目前對于CPE的檢測主要依據(jù)碳青霉烯藥物的水解，對具體的酶類型無法分辨，如果能對酶類型進(jìn)行檢測，將會有更大的應(yīng)用空間。

[1] Livermore DM. Current epidemiology and growing resistance of gram-negative pathogens[J]. Korean J Intern Med, 2012, 27(2): 128-142.

[2] 胡付品,朱德妹,汪復(fù),等.2015年CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志,2016,16(6):685-694.

[3] Goodman KE, Simner PJ, Tamma PD, et al. Infection control implications of heterogeneous resistance mechanisms in carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE)[J]. Expert Rev Infect Ther, 2016, 14(1): 95-108.

[4] Nordmann P, Gniadkowski M, Giske CG, et al. Identification and screening of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J]. Clin Microbiol Infect, 2012, 18(5): 432-438.

[5] Benenson S, Temper V, Cohen MJ, et al. Imipenem disc for detection of KPC carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in clinical practice[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(4): 1617-1620.

[6] Pasteran F, Lucero C, Soloaga R, et al. Can we use imipenem and meropenem Vitek 2 MICs for detection of suspected KPC and other-carbapenemase producers among species of Enterobacteriaceae?[J]. J Clinical Microbiol, 2011, 49(2): 697-701.

[7] Tamma PD, Huang Y, Opene BN, et al. Determining the optimal carbapenem MIC that distinguishes carbapenemase-producing and non-carbapenemase-producing carbapenem-resistant Enterobacteriaceae[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2016, 60(10): 6425-6429.

[8] Fattouh R, Tijet N, McGeer A, et al. What is the appropriate meropenem MIC for screening of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in low-prevalence settings?[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 60(3): 1556-1559.

[9] Adler A, Navon-Venezia S, Moran-Gilad J, et al. Laboratory and clinical evaluation of screening agar plates for detection of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae from surveillance rectal swabs[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(6): 2239-2242.

[10] Panagea T, Galani I, Souli M, et al. Evaluation of CHROMagarTMKPC for the detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in rectal surveillance cultures[J]. Int J Antimicrob Agents, 2011, 37(2): 124-128.

[11] Perry JD, Naqvi SH, Mirza IA, et al. Prevalence of faecal carriage of Enterobacteriaceae with NDM-1 carbapenemase at military hospitals in Pakistan, and evaluation of two chromogenic media[J]. J Antimicrob Chemother, 2011, 66(10): 2288-2294.

[12] Girlich D, Poirel L, Nordmann P. Comparison of the SUPERCARBA, CHROMagar KPC, and Brilliance CRE screening media for detection of Enterobacteriaceae with reduced susceptibility to carbapenems[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2013, 75(2): 214-217.

[13] Nicola FG, Nievas J, Smayevsky J. Evaluation of phenotypic methods for the detection of KPC carbapenemases inKlebsiellapneumoniae[J]. Rev Argent Microbiol, 2012, 44(4): 290-302.

[14] Tsakris A, Poulou A, Pournaras S, et al. A simple phenotypic method for the differentiation of metallo-beta-lactamases and class A KPC carbapenemases in Enterobacteriaceae clinical isolates[J]. J Antimicrob Chemother, 2010, 65(8): 1664-1671.

[15] van Dijk K, Voets GM, Scharringa J, et al. A disc diffusion assay for detection of class A, B and OXA-48 carbapenemases in Enterobacteriaceae using phenyl boronic acid, dipicolinic acid and temocillin[J]. Clin Microbiol Infect, 2014, 20(4): 345-349.

[16] Lee K, ChongY, Shin HB, et al. Modified Hodge and EDTA-disk synergy tests to screen metallo-β-lactamase-producing strains ofPseudomonasandAcinetobacterspecies[J]. Clin Microbiol Infect, 2001, 7(2): 88-91.

[18] Mathers AJ, Carroll J, Sifri CD, et al. Modified Hodge test versus indirect carbapenemase test: prospective evaluation of a phenotypic assay for detection ofKlebsiellapneumoniaecarbapenemase (KPC) in Enterobacteriaceae[J]. J Clin Microbiol, 2013, 51(4): 1291-1293.

[19] Girlich D, Poirel L, Nordmann P. Value of the modified Hodge test for detection of emerging carbapenemases in Enterobacteriaceae[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(2): 477-479.

[20] González LJ, Bahr G, Nakashige TG. Membrane anchoring stabilizes and favors secretion of New Delhi metallo-β-lactamase[J]. Nat Chem Biol, 2016, 12(7): 516-522.

[21] Pasteran F, Gonzalez LJ, Albornoz E, et al. Triton Hodge Test: Improved protocol for modified Hodge test for enhanced detection of NDM and other carbapenemase producers[J]. J Clin Microbiol, 2016, 54(3): 640-649.

[22] Takayama Y, Adachi Y, Nihonyanagi S, et al. Modified Hodge test using Mueller-Hinton agar supplemented with cloxacillin improve screening for carbapenemase-producing clinical isolates of Enterobacteriaceae[J]. J Med Microbiol, 2015, 64(7): 774-777.

[23] Aseem R, Shenoy S, Mala SS, et al. Approach to carbapenemase detection inKlebsiellapneumoniaein routine diagnostic laboratories[J]. J Clin Diagn Res, 2016, 10(12): DC24-DC27.

[24] Nordmann P, Poirel L, Dortet L. Rapid detection of carbapenemase producing Enterobacteriaceae[J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(9): 1503-1507.

[25] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: 25th informational supplement. M100-S25[S]. CLSI, 2015.

[26] Tijet N, Boyd D, Patel SN, et al. Evaluation of the Carba NP test for rapid detection of carbapenemase-producingEnterobacteriaceaeandPseudomonasaeruginosa[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(9): 4578-4580.

[27] Segawa T, Matsui M, Suzuki M, et al. Utilizing the Carba NP test as an indicator of expression level of carbapenemase genes in Enterobacteriaceae[J]. J Microbiol Methods, 2017, 133: 35-39.

[28] Dortet L, Bréchard L, Poirel L, et al. Impact of the isolation medium for detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae using an updated version of the Carba NP test[J]. J Med Microbiol, 2014, 63(Pt 5): 772-776.

[29] Hombach M, von Gunten B, Castelberg C, et al. Evaluation of the Rapidec Carba NP test for detection of carbapenemases in Enterobacteriaceae[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(12): 3828-3833.

[30] Abdel Ghani S, Thomson GK, Snyder JW, et al. Comparison of the Carba NP, modified Carba NP, and updated Rosco Neo-RapidCarb Kit Tests for carbapenemase detection[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(11): 3539-3542.

[31] Pires J, Novais A, Peixe L. Blue-carba, an easy biochemical test for detection of diverse carbapenemase producers directly from bacterial cultures[J]. J Clin Microbiol, 2013, 51(12): 4281-4283.

[32] 胡仁靜,嚴(yán)子禾,韓志君,等.Carba NP 試驗(yàn)及Carba NP-direct試驗(yàn)檢測產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌的臨床意義[J].臨床與病理雜志,2016,36(8):1079-1086.

[33] Srisrattakarn A, Lulitanond A, Wilailuckana C, et al. Modification and evaluation of the Carba NP test by use of paper strip for simple and rapid detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2016, 32(7): 117.

[34] van der Zwaluw K, de Haan A, Pluister GN, et al. The carbapenem inactivation method (CIM), a simple and low-cost alternative for the Carba NP test to assess phenotypic carbapenemase activity in gram-negative rods[J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0123690.

[35] Madkour LA, Soliman MS, Hassan DM, et al. Detection of carbapenemase-producers: Evaluating the performance of the carbapenem inactivation method and Carba NP test versus multiplex PCR[J]. J Glob Antimicrob Resist, 2017, 9: 10-14.

[36] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: 27th informational supplement. M100-S27[S]. CLSI, 2017.

[37] Pierce VM, Simner PJ, Lonsway DR, et al. Modified carbapenem inactivation method for phenotypic detection of carbapenemase production among Enterobacteriaceae[J]. J Clin Microbiol, 2017, 55(8): 2321-2333.

[38] Pragasam AK, Veeraraghavan B, Bakthavatchalam YD, et al. Strengths and limitations of various screening methods for carbapenem-resistant Enterobacteriaceae including new method recommended by clinical and laboratory standards institute, 2017: A tertiary care experience[J]. Indian J Med Microbiol, 2017, 35(1): 116-119.

[39] Rubio E, Zboromyrska Y, Pitart C, et al. Evaluation of a rapid immunochromatographic test for the detection of OXA-48 carbapenemase[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2017, 87(3): 266-267.

[40] Glupczynski Y, Jousset A, Evrard S, et al. Prospective evaluation of the OKN K-SeT assay, a new multiplex immunochromatographic test for the rapid detection of OXA-48-like, KPC and NDM carbapenemases[J]. J Antimicrob Chemother, 72(7): 1955-1960.

[41] Hrabák J, Walková R, Studentová V, et al. Carbapenemase activity detection by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(9): 3222-3227.

[42] Oviaňo M, Sparbier K, Barba MJ, et al. Universal protocol for the rapid automated detection of carbapenem-resistant Gram-negative bacilli directly from blood cultures by matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)[J]. Int J Antimicrob Agents, 2016, 48(6): 655-660.