許光輝 黃亦琦 莊媛 戚歡陽(yáng) 趙淑飛 馬雪云

家蠶治療消渴病的歷史悠久, 在國(guó)內(nèi)外傳統(tǒng)藥物記載中亦不乏關(guān)于家蠶治療消渴病的介紹, 如《本草綱目》對(duì)家蠶描述有：蠶蛹, “煎汁飲, 止消渴”；蠶繭, “煮汁飲, 止消渴”；繅絲湯, “止消渴, 大驗(yàn)”等［1,2］。目前文獻(xiàn)表明, 在治療糖尿病等相關(guān)疾病方面, 家蠶均以幼蟲(chóng)的全體的凍干粉末入藥, 但少見(jiàn)有關(guān)家蠶有效成分提純、精制的研究。本研究在開(kāi)展家蠶提取、精制基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)有效成分家蠶醇提物(silkworm alcoholic extract, SAE)在細(xì)胞水平開(kāi)展藥效活性研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1SAE的制備 取一定量的5齡蠶, 經(jīng)冷凍干燥、粉碎制備成家蠶凍干粉, 加10～30倍的70%乙醇水溶液, 充分?jǐn)嚢? 浸泡 2 h, 超聲 10 min, 重復(fù) 3次, 間隔 10 min/次, 過(guò)濾 ；沉淀再按以上方法提取1次；將2次濾液合并, 減壓濃縮成含有家蠶1 g/ml的貯液, 4℃保存, 用前DMSO稀釋至所需濃度, 22 μm濾膜過(guò)濾除菌。

1.23T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)與分化、脂肪細(xì)胞IR模型的復(fù)制 3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中, 用含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng), 隔天換液；待細(xì)胞長(zhǎng)滿至完全融合48 h后, 采用分化培養(yǎng)基開(kāi)始進(jìn)行分化, 隔天換液；分化72 h后更換含100 ng/ml Insulin的維持培養(yǎng)基,隔天換液；維持培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后, 95%以上的細(xì)胞完全分化為成熟的脂肪細(xì)胞。

分化成熟的脂肪細(xì)胞在含有0.2 nM TNF-α的維持培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h后, 可成功復(fù)制成IR模型［3］。

1.3SAE對(duì)正常脂肪細(xì)胞糖攝取的影響 3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于12孔板中, 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和SAE處理組,每組至少3個(gè)重復(fù)。95%以上的3T3-L1前脂肪細(xì)胞完全分化為成熟的脂肪細(xì)胞后, 給藥組分別加入SAE濃度為250、500 μg /ml和1.0 mg /ml的含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

24 h后空白組與各給藥組用磷酸鹽緩沖液(PBS)淋洗3次, 空白對(duì)照組與各給藥組分別更換無(wú)血清培養(yǎng)基和含藥(濃度為250、500 μg /ml、1.0 mg/ml)的無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)8 h,然后先加入含胰島素100 μM的PBS, 37℃ 孵育20 min, 再加入終濃度為1 mM的2-DG, 37℃ 孵育20 min；用含200 uM phloretin的冷PBS淋洗3次, 然后每孔加入1.5 ml樣品稀釋液,超聲裂解細(xì)胞, 收集細(xì)胞懸液, 80℃加熱15 min；4℃, 15000 g離心20 min, 收集上清液；按照葡萄糖攝取試劑盒要求測(cè)定各組糖攝取情況［4］。

1.4SAE對(duì)IR模型糖攝取的影響 3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于12孔板中, 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、IR模型組和SAE處理組, 每組至少3個(gè)重復(fù)。95%以上的細(xì)胞完全分化為成熟的脂肪細(xì)胞后, IR模型組與SAE處理組更換含0.2 nM TNF-α的維持培養(yǎng)基作用96 h、隔天換液, 誘導(dǎo)IR狀態(tài)；在誘導(dǎo)IR模型的同時(shí), 藥物處理組加入一定濃度的SAE, 直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束［5］。其余步驟同1.3。

1.5SAE對(duì)IRS-1蛋白表達(dá)及其酪氨酸磷酸化的影響3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中, 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、IR模型組和SAE處理組, 每組至少3個(gè)重復(fù), IR模型復(fù)制及給藥方法同1.4。0.2 nM的TNF-α處理96 h后,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞更換無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12 h, 然后加入100 nM的胰島素處理3 min誘導(dǎo)酪氨酸磷酸化, 用預(yù)冷的PBS淋洗細(xì)胞, 加入蛋白裂解液提取總蛋白。免疫印跡法檢測(cè)IRS-1 及其磷酸化蛋白, 各取30 μg蛋白上樣10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)到聚偏二氯乙烯(PVDF)膜上, 5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉 1 h, 一抗4℃孵育過(guò)夜。次日與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h后, 加化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑反應(yīng), 顯像,成像。采用Image J 軟件分析目標(biāo)條帶和內(nèi)參光密度值, 目標(biāo)條帶與內(nèi)參的比值為該目的蛋白相對(duì)含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

500 μg/ml和1.0 mg/ml的SAE均能顯著性增強(qiáng)細(xì)胞的葡萄糖攝取。見(jiàn)圖1。SAE能顯著增強(qiáng)IR細(xì)胞的葡萄糖攝取。見(jiàn)圖2。表明SAE可顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取、明顯改善脂肪細(xì)胞的IR狀態(tài)。與正常3T3-L1脂肪細(xì)胞比較, TNF-α顯著抑制IR模型組IRS-1的表達(dá)及其磷酸化水平(P＜0.01)；與IR模型組比較, SAE可以糾正TNF-α刺激IRS-1的表達(dá)及其磷酸化水平。見(jiàn)圖3、圖4。

圖1 SAE增強(qiáng)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡糖糖攝取的作用注：與空白對(duì)照組比較, aP＜0.05

圖2 SAE改善的3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型葡糖糖攝取的作用注：與空白對(duì)照組比較, aP＜0.01

圖3 SAE對(duì)IRS-L1脂肪細(xì)胞IRS-1及其酪氨酸磷酸化蛋白表達(dá)的電泳

3 討論

通常葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)是在一定濃度的胰島素誘導(dǎo)下進(jìn)行［6］, 而本研究發(fā)現(xiàn)家蠶提取物SAE對(duì)正常脂肪細(xì)胞和IR的脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取均有顯著的增強(qiáng)作用。本研究結(jié)果表明, SAE具有類似胰島素的藥理作用, 且明顯改善炎癥因子引發(fā)的細(xì)胞IR狀態(tài)。

在慢性高胰島素血癥和TNF-α導(dǎo)致的IR中, IRS-1蛋白及其酪氨酸磷酸化蛋白水平明顯下降［7,8］, 本研究發(fā)現(xiàn)SAE可以逆轉(zhuǎn)TNF-α導(dǎo)致的脂肪細(xì)胞IR的狀態(tài), 同時(shí)IRS-1表達(dá)和酪氨酸磷酸化也恢復(fù)到正常水平。

圖4 SAE對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞IRS-1及其酪氨酸磷酸化蛋白表達(dá)的相對(duì)含量

以往研究表明, 家蠶對(duì)2型糖尿病大鼠具有降糖作用［9］, 但具體有效成分不明確。本研究通過(guò)細(xì)胞藥效篩選實(shí)驗(yàn), 證明SAE可能為家蠶降糖的有效部位；SAE通過(guò)恢復(fù)IRS-1表達(dá)水平改善IR。有關(guān)SAE增強(qiáng)細(xì)胞葡萄糖攝取和改善IR的具體分子機(jī)制, 有待于下一步整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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