程長(zhǎng)云，楊麗蕓，劉昱材，賈蕊，張瑞娟，杜惠蘭

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補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸對(duì)小鼠子宮HOXA10表達(dá)的比較研究

程長(zhǎng)云，楊麗蕓，劉昱材，賈蕊，張瑞娟，杜惠蘭

065200 廊坊，河北省三河市醫(yī)院兒科（程長(zhǎng)云）；050200 石家莊，河北中醫(yī)學(xué)院針灸推拿學(xué)院（楊麗蕓、劉昱材、賈蕊、張瑞娟），中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院（杜惠蘭）

觀察補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)小鼠子宮 HOXA10 蛋白及 mRNA 表達(dá)的影響。

將 90 只雌性小鼠隨機(jī)分為 6 組：補(bǔ)腎高、低劑量組，疏肝高、低劑量組，控制性超促排卵組（COH）和空白對(duì)照組，每組 15 只。各組每日腹腔注射生理鹽水，連續(xù) 8 d，第 9 天除空白對(duì)照組外各組注射 PMSG，48 h 后注射 HCG，空白對(duì)照組均腹腔注射生理鹽水。各組分別與雄鼠按 1:1 合籠，次晨觀察妊娠情況后給藥。補(bǔ)腎高、低劑量組分別給予補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方口服液（5.4 和 2.7 g/ml），疏肝高、低劑量組分別給予逍遙丸混懸液（0.6 和 0.3 g/ml），COH 組和空白對(duì)照組給予生理鹽水，連續(xù) 4 d。處死小鼠并取材，應(yīng)用免疫組化和 RT-PCR 方法分別測(cè)定小鼠子宮同源框基因 10（HOXA10）的表達(dá)情況，并比較各組雌、孕激素表達(dá)水平。

各治療組血清雌二醇和孕酮表達(dá)均顯著高于空白對(duì)照組和 COH 組（< 0.05），且高劑量組優(yōu)于低劑量組（< 0.05）；高劑量組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）。與空白對(duì)照組比較，HOXA10 基因在 COH 組表達(dá)降低（< 0.05）；與 COH 組比較，補(bǔ)腎高劑量組和疏肝高劑量組表達(dá)增加（< 0.05）；補(bǔ)腎高劑量組與疏肝高劑量組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）。

補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸可上調(diào)超促排卵小鼠血清雌孕激素水平，提高子宮 HOXA10 的表達(dá)，從而改善小鼠子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)胚胎著床。

補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方； 逍遙丸； HOXA10

體外受精-胚胎移植（fertilization-embryo transfer，IVF-ET）是目前治療不孕癥的主要技術(shù)手段，其在卵泡募集和卵母細(xì)胞的獲取上成功率已達(dá)到 90%，促性腺激素的應(yīng)用可以獲得較多高質(zhì)量卵子[1]，但外源性激素的參與會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性降低，胚胎著床失敗[2]。同源框基因 10（HOXA10）是子宮內(nèi)膜容受性建立及內(nèi)膜增殖分化的重要調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控胚胎著床，與子宮內(nèi)膜容受性關(guān)系密切[3-4]，雌孕激素的數(shù)量及功能調(diào)節(jié)也是影響子宮內(nèi)膜容受性的重要因素[5]。目前，補(bǔ)腎法、疏肝法是治療月經(jīng)病、不孕癥的常用療法，且療效肯定。已有研究表明，補(bǔ)腎法、疏肝法可調(diào)節(jié)卵巢功能，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量和臨床妊娠率[6-7]。本研究以 HOXA10 為切入點(diǎn)，以補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸分別作為補(bǔ)腎法、疏肝法的代表方劑，探討兩種中藥對(duì)小鼠雌孕激素及 HOXA10 表達(dá)的影響及作用機(jī)制的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雌性昆明小鼠90 只，6 ~ 7 周齡，體重 28 ~ 32 g，健康雄性昆明小鼠90只，8 ~ 9周齡，均購(gòu)自河北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：1612191，雌、雄分籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，室溫保持在（20 ± 1）℃，相對(duì)濕度約 50%，自動(dòng)控制光照 12 h，黑暗 12 h。

1.1.2 藥物與試劑 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方包括熟地黃20 g、當(dāng)歸 9 g、山藥 12 g、山茱萸 15 g、女貞子 9 g、枸杞子 12 g、紫河車(chē) 10 g、淫羊藿10 g、菟絲子 12 g、覆盆子 10 g、香附 6 g、白芍 9 g、肉蓯蓉 10 g、丹參 10 g，均購(gòu)自石家莊樂(lè)仁堂，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院中藥系制成口服液，高劑量含生藥 5.4 g/ml，低劑量含生藥 2.7 g/ml，分別相當(dāng)于臨床用藥量（0.81 g/ml）的 20 倍和10 倍；逍遙丸由河南宛西制藥股份有限公司生產(chǎn)，將 200、100 粒逍遙丸分別溶于 125 ml 蒸餾水中制成混懸液，高劑量含生藥 0.6 g/ml，低劑量含生藥 0.3 g/ml，置 4 ℃冰箱中備用；孕馬血清（PMSG）購(gòu)自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所；人絨毛膜促性腺激素（HCG）購(gòu)自麗珠制藥廠(chǎng)；HOXA10 試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒 VECTASTAIN ABC Kit 為美國(guó) Vector Laboratories 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 將 90 只雌性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法完全隨機(jī)化分為 6 組：補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、疏肝高劑量組、疏肝低劑量組、控制性超排卵組（COH）和空白對(duì)照組，每組 15 只。各組每日腹腔注射生理鹽水，連續(xù) 8 d，至第 9 天 9 時(shí)空白對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，其余各組同時(shí)注射 PMSG 10 IU/只。48 h 后空白對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，其余各組腹腔注射 HCG 10 IU/只。當(dāng)晚各組分別與雄鼠按 1:1 進(jìn)行合籠，次日晨 8 時(shí)檢查陰栓，觀察到陰栓者記為妊娠第 1 天。于妊娠第 1 ~4 天，補(bǔ)腎高、低劑量組分別給予補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方口服液（5.4 和 2.7 g/ml）；疏肝高、低劑量組分別給予逍遙丸混懸液（0.6 和 0.3 g/ml）；對(duì)照組和 COH 組每天灌服生理鹽水。各組小鼠均以 1 ml/100 g 體重灌胃，連續(xù)給藥 4 d。

1.2.2 標(biāo)本采集 妊娠第 4 天晚 10 點(diǎn)每組小鼠于尾靜脈注射 0.2 ml 體積分?jǐn)?shù) 0.5% 的伊文思藍(lán)，摘除眼球法取血 3 ml，（24 ± 2）℃ 室溫靜置2 h 后 3000 r/min 離心 3 min，取血清置于 –20 ℃冰箱中保存。各組小鼠取血后脫頸椎處死。剖腹取子宮并分離，生理鹽水漂洗后，將每只小鼠的子宮左右角分開(kāi)，一半子宮于體積分?jǐn)?shù) 4% 多聚甲醛溶液中固定，脫水并石蠟包埋，用于免疫組化檢測(cè)，另一半子宮于–80 ℃保存，以備檢測(cè) mRNA。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1 免疫組化染色 用免疫組化 SP 法制備切片，對(duì)子宮內(nèi)膜組織切片 HOXA10 蛋白進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察 HOXA10 的表達(dá)情況，以組織中呈現(xiàn)出棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)，選取同批次切片，每張切片隨機(jī)收集 10 個(gè)視野圖像，經(jīng)HMIAS-2000 顯微圖像系統(tǒng)分析，測(cè)定陽(yáng)性信號(hào)的平均分光光度值，比較組間著色差異。

1.2.3.2 RT-PCR 取 100 mg 組織按照試劑盒說(shuō)明提取總 RNA，并進(jìn)行相關(guān)濃度及純度的測(cè)定定量；取總 RNA 2 μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；目標(biāo)基因 mRNA 拷貝數(shù)使用GAPDH 作為內(nèi)參校正，引物序列及退火溫度分別為：HOXA10（472 bp）：上游引物：5' TTTTGG TCGACTCGCTCATCA 3'，下游引物：5' CATTTG TCCGCAGCATCGTA 3'，退火溫度 54 ℃；GAPDH（615 bp）：上游引物：5' GACCACAGTCCATGC CATCA 3'，下游引物：5' CCCTAGGCCCCTCCTG TTAT 3'。PCR 反應(yīng)體系振蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于 PCR 儀擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃變性 3 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。取每個(gè)標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物 6 μl于 1% 的含 GV 核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，以 DL2000 作為標(biāo)準(zhǔn)片段標(biāo)記，電泳后于紫外透射儀觀察，并用數(shù)碼相機(jī)照相，應(yīng)用 Quantity One 凝膠圖像分析軟件對(duì)目的電泳條帶進(jìn)行分析，以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結(jié)果以?xún)烧咧e分吸光度的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清雌二醇和孕酮比較

與空白對(duì)照組比較，其他各組血清雌二醇（E2）和孕酮（P）表達(dá)水平升高（< 0.05）；與 COH 組比較，各治療組血清 E2和 P 水平升高（< 0.05），且高劑量組表達(dá)優(yōu)于低劑量組（< 0.05），補(bǔ)腎高劑量組和疏肝高劑量組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）（表 1）。

2.2 各組小鼠子宮內(nèi)膜 HOXA10 mRNA 表達(dá)情況

與空白對(duì)照組比較，HOXA10 基因在 COH 組表達(dá)降低（< 0.05）；與 COH 組比較，補(bǔ)腎高劑量組和疏肝高劑量組表達(dá)增加（< 0.05），補(bǔ)腎低劑量組和疏肝低劑量組表達(dá)增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）。補(bǔ)腎高劑量組與疏肝高劑量組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）（圖 1 和表 2）。

2.3 各組小鼠子宮內(nèi)膜 HOXA10 蛋白免疫組化結(jié)果

由圖 2 可見(jiàn)，HOXA10 蛋白在子宮內(nèi)膜上皮及間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，控制性超排卵組 HOXA10 蛋白表達(dá)降低，空白對(duì)照組及各治療組表達(dá)升高（表 3）。

表 1 各組小鼠血清 E2和 P 水平比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，*< 0.05；與控制性超排卵組比較，△< 0.05；與疏肝低劑量組比較，□< 0.05；與疏肝高劑量組比較，▽< 0.05；與補(bǔ)腎低劑量組比較，#< 0.05；與補(bǔ)腎高劑量組比較，▲< 0.05。

Notes: Compared with the blank control,*< 0.05; compared with the COH,△< 0.05; compared with shugan low dose group,□< 0.05; compared with shugan high dose group,▽< 0.05; compared with bushen low dose group,#< 0.05; compared with bushen high dose group,▲< 0.05.

M：DL2000；1：空白對(duì)照組；2：COH 組；3：補(bǔ)腎低劑量組；4：補(bǔ)腎高劑量組；5：疏肝低劑量組；6：疏肝高劑量組

Figure 1 Expression of HOXA10 mRNA in the mice womb in each group

表 2 各組小鼠子宮 HOXA10 mRNA 比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，*< 0.05；與控制性超排卵組比較，△< 0.05；與疏肝低劑量組比較，□< 0.05；與疏肝高劑量組比較，▽< 0.05；與補(bǔ)腎低劑量組比較，#< 0.05；與補(bǔ)腎高劑量組比較，▲< 0.05。

Notes: Compared with the blank control,*< 0.05; compared with the COH,△< 0.05; compared with shugan low dose group,□< 0.05; compared with shugan high dose group,▽< 0.05; compared with bushen low dose group,#< 0.05; compared with bushen high dose group,▲< 0.05.

3 討論

胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性是胚胎成功著床的關(guān)鍵因素，多方面研究表明，超促排卵藥物的應(yīng)用對(duì)子宮內(nèi)膜容受性產(chǎn)生不良影響[8]，而子宮內(nèi)膜容受性的損害所致的著床失敗占到2/3，是導(dǎo)致 IVF-ET 失敗的主要原因之一[9]。

子宮內(nèi)膜容受性即子宮內(nèi)膜成功允許胚胎著床的接受性狀態(tài)，這一時(shí)期稱(chēng)為著床窗口期，子宮內(nèi)膜容受性除了與下丘腦-垂體-卵巢軸的相關(guān)激素有關(guān)，還受到各種細(xì)胞因子的影響。同源框基因（HOX）是調(diào)控子宮內(nèi)膜容受性和胚胎發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，其中 HOXA10 在雌性生殖系統(tǒng)表達(dá)，可調(diào)控胚胎發(fā)育及植入，在子宮內(nèi)膜容受性方面起著重要作用。研究表明，HOXA10 基因敲除小鼠的胚胎在正常小鼠子宮內(nèi)能正常發(fā)育至分娩，而正常小鼠胚胎不能在 HOXA10 基因缺陷小鼠子宮內(nèi)著床，可能與子宮在著床期降低了對(duì)孕酮的反應(yīng)有關(guān)[10-11]；研究還發(fā)現(xiàn)，HOXA10 基因缺失或表達(dá)下降，會(huì)使子宮內(nèi)膜容受性下降，著床窗口期延后，著床窗口期開(kāi)放時(shí)間與胚胎發(fā)育不同步，導(dǎo)致胚胎植入失敗和臨床妊娠率下降[12]。因此，目前HOXA10 基因水平常作為子宮內(nèi)膜容受性建立的標(biāo)志之一[13]。

圖 2 各組小鼠子宮內(nèi)膜 HOXA10 表達(dá)情況（A：空白對(duì)照組；B：COH 組；C：補(bǔ)腎低劑量組；D：補(bǔ)腎高劑量組；E：疏肝低劑量組；F：疏肝高劑量組）（× 400）

Figure 2 Expression of HOXA10 in endometrium of mice in each group (A: Blank control group; B: COH group; C: Bushen low dose group; D: Bushen high dose group; E: Shugan low dose group; F: Shugan high dose group) (× 400)

組別 GroupsnOD值 OD value 空白對(duì)照 Blank control100.76 ± 0.0.29△□# 控制性超排卵 COH100.33 ± 0.13*▽□▲# 補(bǔ)腎低劑量 Bushen low dose100.56 ± 0.13△*▲▽ 補(bǔ)腎高劑量 Bushen high dose100.85 ± 0.16△□# 疏肝低劑量 Shugan low dose100.55 ± 0.18△*▲▽ 疏肝高劑量 Shugan high dose100.86 ± 0.15△□#

注：與空白對(duì)照組比較，*< 0.05；與控制性超排卵組比較，△< 0.05；與疏肝低劑量組比較，□< 0.05；與疏肝高劑量組比較，▽< 0.05；與補(bǔ)腎低劑量組比較，#< 0.05；與補(bǔ)腎高劑量組比較，▲< 0.05。

Notes: Compared with the blank control,*< 0.05; compared with the COH,△< 0.05; compared with shugan low dose group,□< 0.05; compared with shugan high dose group,▽< 0.05; compared with bushen low dose group,#< 0.05; compared with bushen high dose group,▲< 0.05.

HOXA10 基因在子宮內(nèi)膜的表達(dá)與雌二醇和孕酮關(guān)系密切。對(duì)原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞株研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇能刺激內(nèi)膜細(xì)胞 HOXA10 表達(dá)，使其表達(dá)增加 2 倍[14-15]；孕酮可通過(guò) HOXA10 調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)的分化[16]，也可調(diào)節(jié) HOXA10 以劑量依賴(lài)性的方式增加至 25 倍[15]。因此，高水平的雌孕激素與子宮內(nèi)膜相應(yīng)受體結(jié)合后，可激活 HOXA10 基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖，為胚胎植入提供條件。

近些年，中藥在改善子宮內(nèi)膜容受性方面研究廣泛且療效明確。補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方由養(yǎng)精種玉湯合五子衍宗丸加減化裁而成，方中以熟地滋補(bǔ)肝腎為君；枸杞子、山萸肉、覆盆子、菟絲子、淫羊藿等助君藥滋陰諸陽(yáng)，共為臣藥，以使“陰得陽(yáng)升而泉源不竭”；當(dāng)歸、白芍、丹參調(diào)經(jīng)養(yǎng)血，紫河車(chē)為佐藥，共奏調(diào)和陰陽(yáng)，備子育胎之效，體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)“腎主生殖”、“精滿(mǎn)則子宮易于攝精，血足則子宮易于容物”的理論思想。逍遙丸為疏肝法代表方藥，以四逆散演化而來(lái)，方中柴胡疏肝解郁為君藥，當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血斂陰為臣藥，茯苓、白術(shù)、甘草實(shí)木抑土，化生營(yíng)血，諸藥合用，條暢沖任，以達(dá)經(jīng)調(diào)子嗣之效。

本研究顯示，各治療組雌二醇和孕酮表達(dá)水平顯著高于 COH 組，補(bǔ)腎高劑量組和疏肝高劑量組小鼠子宮內(nèi)膜 HOXA10 蛋白及基因表達(dá)均顯著高于 COH 組，說(shuō)明補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸的應(yīng)用不會(huì)影響促性腺激素的應(yīng)用，并能與之協(xié)同作用上調(diào)血清雌孕激素水平，并進(jìn)而調(diào)控 HOXA10 基因在子宮內(nèi)膜的表達(dá)；補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方高劑量組 HOXA10 蛋白及 mRNA 的表達(dá)均優(yōu)于低劑量組，逍遙丸高劑量組 HOXA10 蛋白及 mRNA 的表達(dá)優(yōu)于補(bǔ)腎低劑量組，補(bǔ)腎高劑量與疏肝高劑量組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸對(duì)小鼠血清激素水平及子宮內(nèi)膜 HOXA10 的表達(dá)影響具有劑量關(guān)聯(lián)性，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)雌、孕激素水平改變 HOXA10 基因在子宮內(nèi)膜的表達(dá)，并調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性。肝腎兩臟影響機(jī)制相似，進(jìn)一步證實(shí)了中醫(yī)學(xué)肝腎同源，女子以肝為先天等理論，為臨床不孕癥的治療提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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Comparative study of bushen tiaojing recipe and xiaoyao pill on the expression of HOXA10 in mouse womb

CHENG Chang-yun, YANG Li-yun, LIU Yu-cai, JIA Rui, ZHANG Rui-juan, DU Hui-lan

Author Affiliations: Pediatrics of Hebei Sanhe Hospital, Langfang 065200, China (CHENG Chang-yun); Acupuncture Massage School (YANG Li-yun, LIU Yu-cai, JIA Rui, ZHANG Rui-juan), Chinese and Western Medicine (DU Hui-lan), Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China

To investigate the effects of bushen and shugan treatment on the protein and mRNA expression of HOXA10 in mouse womb.

90 female mice were randomly divided into 6 groups: high and low dose bushen group; high and low dose shugan group; super stimulate ovulation control group (COH) and blank control group, with 15 mice in each group. The daily injection of saline was performed in each group for 8 d. All the mice in each group injected with PMSG in the 9th day and injected HCG after 48 h except the mice in control group. The female mice in each group was mated with the male mice, followed by observation of the pregnancy on the second morningand further drug treatment, high and low dose bushen group were given with 5.4 g/ml or 2.7 g/ml oral liquid filling kidney menstrual function party; high and low dose shugan group were given with 0.6 g/ml or 0.3 g/ml liver xiaoyao pill for suspension liquid, and the COH and the blank control group were injected with saline for 4 d. After sacrifice of the mice, immunohistochemistry and RT-PCR method was used to analyze HOXA10 expression in mouse uterus, and female progestational hormone expression level was compared.

Expression of serum E2 and P in each treatment group was significantly higher than that of the blank control group and the COH group (< 0.05), and the high dose group was superior to the low-dose group (< 0.05). Comparison between the high dose groups had no statistical significance (> 0.05). The HOXA10 gene expression in COH group was reduced as compared with blank control group (< 0.05), whereas the expression of HOXA10 in the high-dose bushen group and the high-dose shugan group were increased compared with the COH group (< 0.05). No statistically significant difference was seen between the high-dose bushen group and the high-dose shugan group (> 0.05).

Bushen tiaojing recipe and xiaoyao pill can raise the ultra female serum progesterone level of mice, increase HOXA10 expression in uterus and improve the endometrial receptivity, thus promoting embryo implantation.

Bushen tiaojing recipe; Xiaoyao pill; HOXA10

YANG Li-yun, Email: gyldyly@163.com

河北省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2016013）；河北中醫(yī)學(xué)院博士課題項(xiàng)目（7000120007）

楊麗蕓，Email：gyldyly@163.com

2017-11-02

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.010