李昱，楊庚

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白細(xì)胞介素12對(duì)耐藥結(jié)核大鼠模型的影響

李昱，楊庚

710086 西安，武警工程大學(xué)醫(yī)院衛(wèi)勤科（李昱），檢驗(yàn)科（楊庚）

觀察、評(píng)價(jià)白細(xì)胞介素 12（IL-12）對(duì)耐藥結(jié)核大鼠模型的臟器菌落變化和細(xì)胞因子水平的影響。

將 60 只 SD 雌性大鼠經(jīng)尾靜脈感染結(jié)核分枝桿菌耐利福平株，每只 106CFU，制成耐藥結(jié)核大鼠模型，隨機(jī)分為對(duì)照組和 IL-12 組，每組 30 只。給予 PBS 或 IL-12 治療 7 d，ELISA 法檢測(cè)血清 IFN-γ 水平、流式細(xì)胞術(shù)行 T 細(xì)胞亞群檢測(cè)和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定器官菌落計(jì)數(shù)，觀察治療后生存率。

IL-12 組大鼠 1 只死亡，肺、肝、脾菌落數(shù)分別為（254 ± 98）× 105、（5 ± 2）× 105和（16 ± 4）× 105CFU/ml，IFN-γ（1125 ± 378）pg/ml；PBS 組 10 只死亡，肺、肝、脾菌落數(shù)分別為（682 ± 304）× 105、（28 ± 17）× 105和（108 ± 35）× 105CFU/ml，IFN-γ（532 ± 198）pg/ml，兩組比較差異有顯著性。淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定顯示 IL-12 促進(jìn) Th1 細(xì)胞反應(yīng)，改變了 Th1/Th2 平衡，兩組比較差異有顯著性。

IL-12 誘導(dǎo) IFN-γ 產(chǎn)生，促進(jìn) Th1 細(xì)胞反應(yīng)，改變了 Th1/Th2 平衡，對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染大鼠產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。

白細(xì)胞介素 12； 廣泛耐藥結(jié)核； 大鼠； 白細(xì)胞介素 18； Th1-Th2 平衡

半個(gè)世紀(jì)以來，結(jié)核病的傳染性在全球一直高居前列[1]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)和醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，耐多藥結(jié)核病儼然成為結(jié)核病控制工作的重中之重，嚴(yán)重威脅人們?cè)诮Y(jié)核病控制領(lǐng)域取得的成就。患者在治療時(shí)常常由于出現(xiàn)不良反應(yīng)而失去繼續(xù)治療的信心，治療依從性大大降低。而耐多藥結(jié)核病疫情回升已成為威脅全球的公共衛(wèi)生問題。我國(guó)作為全球 27 個(gè)耐多藥肺結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，每年新發(fā)耐多藥結(jié)核患者位居全球第二位。

隨著結(jié)核病學(xué)的發(fā)展和研究，抗結(jié)核藥物的開發(fā)和應(yīng)用使得結(jié)核病的傳染得到了有效控制[2]。異煙肼（INH）和利福平（RFP）是目前醫(yī)學(xué)上抗結(jié)核病應(yīng)用最為廣泛的一線藥品，是決定結(jié)核病治療效果和治療方案的關(guān)鍵因素之一[3-5]。然而，由于長(zhǎng)期大劑量的藥物使用，耐藥菌株不斷產(chǎn)生。已有研究表明，利福平耐藥性結(jié)核分枝桿菌往往會(huì)同時(shí)表現(xiàn)出多種耐藥性，因此，研究耐利福平結(jié)核病對(duì)結(jié)核患者的治療具有重要意義。此外諸多研究還表明，結(jié)核分枝桿菌的機(jī)體感染可能引起較為強(qiáng)烈的機(jī)體免疫反應(yīng)。其免疫反應(yīng)主要表現(xiàn)在：T 細(xì)胞亞群比例失衡；γ-干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素 12（IL-12）等細(xì)胞因子分泌水平明顯上調(diào)。這提示這些淋巴細(xì)胞的分化和細(xì)胞因子分泌水平的變化可能會(huì)有助于緩解結(jié)核病的發(fā)展。

傳統(tǒng)的化學(xué)藥物療法已頗顯弊端，近年來更具針對(duì)性的生物免疫因子療法成為解決這一難題的重要手段[6-8]。IL-12 主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，近年來在抗病毒感染、抗寄生蟲入侵和抗腫瘤等方面表現(xiàn)出了極佳的療效[9-11]，并日益受到免疫學(xué)家的青睞。作為一種具有多種活性的生物免疫應(yīng)答調(diào)變器，IL-12 可以促進(jìn) T 細(xì)胞增殖活化，誘導(dǎo) T0 細(xì)胞向 Th1 分化，提高 Th1/Th2 的比例；可刺激多種免疫細(xì)胞 IFN-γ、IL-2、TNF-α 等細(xì)胞因子，進(jìn)而提高機(jī)體殺滅病原微生物的能力[12-14]。本研究旨在通過IL-12 對(duì)耐藥結(jié)核模型大鼠的治療，探究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器菌落、細(xì)胞因子水平以及T 淋巴細(xì)胞亞群比例的影響，以研究IL-12 對(duì)耐利福平結(jié)核分枝桿菌感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)作用，以期為結(jié)核病的生物免疫因子治療提供借鑒和支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康 SD 大鼠 60 只，雄性，約 2.5 月齡，體重 300 ~ 350 g，由陜西省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室提供。室溫 25 ℃，濕度 50% ~ 80%，SPF 環(huán)境下自由飲水和采食。

1.1.2 儀器與試劑 PBS 磷酸緩沖液由美國(guó)Hyclone 公司提供；細(xì)菌培養(yǎng)箱購(gòu)自北京金恒祥儀器有限公司；CD3（APC-CD3）、葉綠素?zé)晒獾鞍祝≒reCP）等免疫抗體購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz 公司；ELISA 試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司；結(jié)核分枝桿菌耐利福平株購(gòu)于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治臨床中心。

1.2 方法

1.2.1 建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图皩?shí)驗(yàn)分組 將 60 只 SD 大鼠經(jīng)尾靜脈注射結(jié)核分枝桿菌耐利福平株，106CFU/只，制成耐藥結(jié)核大鼠模型。將所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均隨機(jī)分為兩組，即對(duì)照組和 IL-12 組。對(duì)照組大鼠每只腹腔注射 200 μl PBS 磷酸緩沖液，IL-12 組腹腔注射 200 μl 重組大鼠 IL-12（含有 0.2 μg IL-12 的 PBS 溶液），從結(jié)核分枝桿菌感染大鼠后當(dāng)天下午開始，連續(xù)腹腔注射 7 d。

1.2.2 ELISA 法檢測(cè)血清 IFN-γ 水平 連續(xù)給藥 7 d 后，各實(shí)驗(yàn)組分別取 10 只大鼠稱重，按照 0.3 ml/100 g 注射 100 g/L 水合氯醛溶液麻醉，眼球抗凝管采血備用。取部分大鼠血液，4000 r/min離心機(jī)離心取血清，用 ELISA 試劑盒測(cè)定 IFN-γ 含量。

1.2.3 器官菌落計(jì)數(shù) 取新鮮大鼠肺、肝、脾臟的全份臟器，10 000 r/min 組織勻漿，30 s 制成組織勻漿液。用高溫滅菌的 PBS 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臟器勻漿液以 1:10 的重量體積比進(jìn)行稀釋，按1 × 102/ml將其接種在結(jié)核分枝桿菌平板羅氏培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng) 23 d 后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

1.2.4 大鼠臟器中結(jié)核分枝桿菌 HE染色 將大鼠的胸腹腔剖開用注射器吸取滅菌生理鹽水，將針頭準(zhǔn)確刺入心腔，緩慢注入 10 ml 進(jìn)行心臟的灌流。將肺、肝、脾取出放入平皿中，置于冰上，用 PBS 緩沖液進(jìn)行沖洗。取各部分組織固定，經(jīng)分級(jí)系列酒精脫水，縱向切片，厚度約 20 μm。行 HE 及抗酸染色，并觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)行 T 細(xì)胞亞群檢測(cè) 取新鮮外周靜脈血 3 ml，密度梯度離心法分離外周血淋巴細(xì)胞，隨后離心洗滌兩次；將外周血淋巴細(xì)胞重懸于 1 ml RPMI1640 培養(yǎng)液中，調(diào)整 PBMC 濃度為 1.00 × 106/ml。以加入 50 μg/ml PMA 和 0.75 μg/ml 離子霉素的 RPMI1640 培養(yǎng)液對(duì)外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 h 后，取出離心洗滌，加入 APC-CD3 抗體、PreCP-CD8 抗體表面標(biāo)記染色細(xì)胞，室溫避光孵育 15 min，洗滌后破膜，再次洗滌后加入 FITC-IFN-γA 和 PE-IL-4A 抗體?室溫避光孵育并洗滌后，用 PBS 磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，18 ~ 24 h 內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) Th1 細(xì)胞和 Th2 細(xì)胞?每份樣品計(jì)數(shù) 20 000 ~ 30 000 個(gè)細(xì)胞?

1.2.6 觀察治療后生存率 觀察剩余的 40 只大鼠的存活情況，以結(jié)核桿菌感染當(dāng)天開始計(jì)時(shí)，觀察 60 d 后各實(shí)驗(yàn)組大鼠的生存率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血清 IFN-γ 水平檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組大鼠血清中 IFN-γ 水平[（532 ±198）pg/ml]相比，IL-12 組大鼠血清中的 IFN-γ 水平顯著提高[（1125 ± 378）pg/ml]，差異具有顯著性意義（< 0.05）。

2.2 各組器官菌落計(jì)數(shù)

如表 1 可知，即對(duì)照組大鼠 3 個(gè)臟器中結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)均顯著高于 IL-12 組，差異具有顯著性意義（0.05）。由圖1 可見，對(duì)照組大鼠3 個(gè)臟器可見慢性肉芽腫性炎性改變，對(duì)照組較 IL-12 組明顯。

表 1 IL-12 對(duì)耐藥結(jié)核分枝桿菌感染大鼠模型肺臟、肝臟和脾臟中菌落數(shù)目的影響（× 105 CFU）

注：與對(duì)照組比較，< 0.05。

Note: Compared with control group,< 0.05.

2.3 血液 T 淋巴細(xì)胞亞群的變化

如表 2 所示，與對(duì)照組相比，IL-12 組大鼠血液中 Th1、Th2、Th1/Th2 細(xì)胞百分率均升高（均< 0.05）。

圖 1 各組大鼠 3 個(gè)臟器中結(jié)核分枝桿菌觀察（HE × 40）

Figure 1 Observation of mycobacterium tuberculosis in 3 organs of rats in each group (HE × 40)

表 2 IL-12 對(duì)耐藥結(jié)核桿菌模型大鼠血液中=Th1/Th2 的影響（%）

Table 2 The effect of IL-12 on the blood Th1/Th2 in the ratmodel of drug-resistant mycobacterium tuberculosis (%)

組別 GroupsTh1Th2Th1/Th2 對(duì)照組 Control group2.73 ± 0.251.78 ± 0.321.69 ± 0.27 IL-12組 IL-12 group5.41 ± 0.46*2.54 ± 0.41*2.64 ± 0.24*

注：*與對(duì)照組比較，< 0.05。

Note:*Compared with control group,< 0.05.

2.4 治療后生存率

腹腔注射大鼠 60 d 后，記錄兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組共40 只大鼠的存活情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠死亡 10 只，生存率50%，而 IL-12 組大鼠死亡1 只，生存率95%。

3 討論

IL-12 是機(jī)體內(nèi)一種重要的生物免疫調(diào)節(jié)劑，常作為聯(lián)系先天固有免疫和后天獲得性免疫的橋梁而發(fā)揮特殊的免疫作用[15-17]。IL-12 可以誘導(dǎo) T 淋巴細(xì)胞亞群的免疫應(yīng)答平衡變化，引起Th1 的增殖和分化并增強(qiáng) T 細(xì)胞的免疫能力，促進(jìn) T 淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞分泌更高水平的 γ 型干擾素。外源性 IL-12 也常作為免疫調(diào)節(jié)劑使用[18-20]，外源 IL-12 可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞表面 IL-2 受體的高水平表達(dá)，而 IL-2 又可以誘導(dǎo) IL-12 受體的表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步提高機(jī)體的免疫反應(yīng)水平。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2017 全球結(jié)核病報(bào)告》指出，結(jié)核病為全球第九大致死疾病，甚至高于艾滋病。2016 年，全球HIV 陰性人群中有約 130 萬結(jié)核病患者，HIV 呈陽性人群中有 37.4 萬人因結(jié)核病死亡。隨著利福平等藥物的臨床應(yīng)用，耐藥性結(jié)核分枝桿菌的危害也在逐年增加。因此，尋求具有針對(duì)性且安全有效的治療手段迫在眉睫。

本實(shí)驗(yàn)通過尾靜脈注射耐藥性結(jié)核分枝桿菌構(gòu)建結(jié)核病大鼠模型，并腹腔注射外源性IL-12，探討了外源 IL-12 腹腔注射治療干預(yù)對(duì)結(jié)核病大鼠的保護(hù)效應(yīng)。結(jié)果顯示，IL-12 的腹腔干預(yù)治療顯著提高了實(shí)驗(yàn)大鼠血清中干擾素-γ 的分泌水平，提高了 Th1 淋巴細(xì)胞的數(shù)目并調(diào)節(jié)了 Th1/Th2 平衡，顯著降低了大鼠臟器中結(jié)核分枝桿菌數(shù)目；顯著延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活時(shí)間并明顯降低了大鼠的死亡率。這與張?zhí)焱械萚21]的研究結(jié)果較為一致。IL-12 可以誘導(dǎo) Th0 向 Th1 細(xì)胞的分化，促使 T 淋巴細(xì)胞亞群平衡的漂移，此系 IL-12 干預(yù)治療結(jié)核病的重要機(jī)制之一。Th1 是分泌 IFN-γ 細(xì)胞因子的重要淋巴細(xì)胞，且 IFN-γ 具有選擇 Th1 細(xì)胞亞群為主要免疫應(yīng)答的特點(diǎn)。IFN-γ 可正反饋加強(qiáng)自身優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步影響 Th1/Th2 兩種亞群之間的平衡。干擾素-γ 是抗結(jié)核的重要免疫細(xì)胞因子，其可以協(xié)同巨噬細(xì)胞殺滅機(jī)體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，并且阻止結(jié)核菌的擴(kuò)散[22]。

IL-12 可通過誘導(dǎo) IFN-γ 分泌，抑制 IL-4 合成，從而調(diào)節(jié) Th1/Th2 平衡，對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染患者產(chǎn)生保護(hù)性的免疫反應(yīng)。IL-12 尤其適應(yīng)細(xì)胞免疫功能低下宿主合并結(jié)核分枝桿菌感染的狀態(tài)，其可作為結(jié)核免疫調(diào)節(jié)劑，對(duì)結(jié)核新疫苗的開發(fā)研制具有指導(dǎo)意義。陳敬等[23]對(duì) 25 例結(jié)核患者的研究表明，IL-12 可以通過誘導(dǎo) IFN-γ 的分泌，起到抑制 IL-4 合成，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡的作用，對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染患者產(chǎn)生保護(hù)性的免疫反應(yīng)。IL-12 能夠作為結(jié)核免疫調(diào)節(jié)劑，并可用于開發(fā)結(jié)核新疫苗。因此，人為免疫細(xì)胞因子干預(yù)治療可以有效控制結(jié)核病，本實(shí)驗(yàn)的成功為結(jié)核病的免疫治療開拓了新的途徑和思路。

綜上所述，我們認(rèn)為 IL-12 作為免疫細(xì)胞因子在自身免疫性疾病等方面的治療中有著廣闊的應(yīng)用前景。有關(guān)IL-12 的治療時(shí)機(jī)、最佳劑量、毒副作用和合并使用抗結(jié)核藥物的相互關(guān)系以及療程、安全性、療效等問題仍需多中心、大樣本、觀察期長(zhǎng)的臨床研究提供更有力的依據(jù)，積累更多的臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，以便更好地指導(dǎo)臨床治療工作。

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The effect of interleukin-12 on rat model of drug-resistant tuberculosis

LI Yu, YANG Geng

Author Affiliations: Medical Services Section (LI Yu), Laboratory (YANG Geng), People's Armed Police Hospital Engineering University, 710086 Xi’an, China

To observe and evaluate the effect of interleukin-12 (IL-12) on the changes of total bacterial count in viscera and cytokine levels of rats with resistant tuberculosis.

The 60 resistant tuberculosis animal models were made by tail vein injection of rifampin-resistant tuberculosis (106CFU/rat). The 60 rats were divided into control group (n = 30) and IL-12 group (n = 30). The rats in control group and IL-12 group were intraperitoneally injected into PBS or IL-12 treatment for 7 d. The IFN-γ levels in the plasma of rats were measured by the ELISAmethod. The subpopulations of T lymphocytes were determined by the flow cytometry. The bacteria counts were measured by the plant colony counting method, and the survival rates of rats were tested after the treatment.

In the IL-12 group, one rat was dead. In this group, the bacteria colony counts in the lung, liver and spleen were (254 ± 98) × 105, (5 ± 2) × 105, and (16 ± 4) × 105CFU/ml, respectively. The IFN-γ level of IL-12 treatment group was (1125 ± 378) pg/ml. In the control group, ten rats were died, the bacteria colony counts in the three organs were (682 ± 304) × 105, (28 ± 17) × 105, and (108 ± 35) × 105CFU/ml, respectively. The IFN-γ concentration of rats in IL-12 group was (532 ± 198) pg/ml. The significant difference was observed in both experimental groups. The results of the T lymphocytes subpopulations showed that the treatment of IL-12 significantly improved the Th1 cell-mediated immunity and adjusted the balance of Th1/Th2.

The treatment of IL-12 possesses a protective effect on rats of rifampin-resistant tuberculosis by triggering the IFN-γ production, improving the Th1 cell immunity, and changing the balance of Th1/Th2.

Interleukin-12; Extensively drug-resistant tuberculosis; Rats; Interleukin-18; Th1-Th2 balance

LI Yu, Email: baidongqwe@163.com

武警工程大學(xué)基礎(chǔ)研究基金（WJY201620）

李昱，Email：baidongqwe@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.011

2017-11-06