謝鍇標(biāo) 陳震堯 吳美珠

[摘要]目的 研究烏芪舒筋通絡(luò)片質(zhì)量控制的可行方法。方法 采用薄層色譜法鑒別處方中的細(xì)辛、桂枝、牛大力，并采用高效液相色譜法測(cè)定處方中續(xù)斷的川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量。結(jié)果 細(xì)辛、桂枝、牛大力的薄層色譜法鑒別專屬性強(qiáng)，陰性無干擾；川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量在491.7～1966.8 ng（r=0.9996）范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率為101.25%（n=9），RSD為1.40%。結(jié)論 定性、定量方法操作簡單，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，能夠有效地控制烏芪舒筋通絡(luò)片的質(zhì)量，可為該制劑的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)的依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]烏芪舒筋通絡(luò)片；高效液相色譜法；薄層色譜法；川續(xù)斷皂苷Ⅵ；質(zhì)量控制

[中圖分類號(hào)] R927.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）12（c）-0038-04

[Abstract] Objective To study the feasible method for quality control of Wuqi Shujin Tongluo Tablets. Methods TLC was used to identify Asarum， Cinnamon Twig and Niu Dali in the prescription， and HPLC was used to determine the content of Dipsacus Aspergillus saponin Ⅵ in the prescription. Results The TLC method of Asarum， Cinnamon Twig cassia and Niu Dali had strong specificity and no negative interference. The content of Dipsacus saponin Ⅵ had a good linear relationship between 491.7 and 1966.8 ng （R=0.9996）. The average recovery of sample addition was 101.25% （n=9） and RSD was 1.40%. Conclusion The qualitative and quantitative methods are easily operated and with excellent specificity and reproducibility.They can effectively control the quality of Wuqi Shujin Tongluo Tablets， and provide scientific basis for the test standard of the preparation.

[Key words] Wuqi Shujin Tongluo Tablets； HPLC； TLC； Diathesis saponin Ⅵ； Quality control

烏芪舒筋通絡(luò)片是骨傷科的專科特色制劑，具有補(bǔ)肝腎、通絡(luò)止痛的作用[1]，治療坐骨神經(jīng)痛，軟組織疼痛有較好療效。該產(chǎn)品是由多種中草藥如制川烏、續(xù)斷、細(xì)辛、牛大力、黃芪等制成的純中藥制劑，多種成分具有抗菌活性[2]。因其含有制川烏、制草烏，故常規(guī)檢驗(yàn)中應(yīng)增加烏頭堿限量檢測(cè)[3]。原標(biāo)準(zhǔn)為《廣東省食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)》，只有針對(duì)防已所含的漢防已堿成分的理化鑒別、續(xù)斷所含的龍膽堿成分的理化鑒別，專屬性不強(qiáng)，質(zhì)量控制方法相對(duì)落后，生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較大[4-5]，為確保本制劑安全有效，現(xiàn)按《廣東省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑質(zhì)量制訂的技術(shù)要求》，對(duì)該制劑的質(zhì)量檢驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，建立了用薄層色譜鑒別法鑒別方中細(xì)辛、桂枝、牛大力，用高效液相色譜法測(cè)定方中續(xù)斷的川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量。

1儀器與試藥

1.1主要儀器

Agilent 1260-LC型液相色譜儀（美國Agilent公司），Sartorius CPA225D型電子天平（德國賽多利斯公司），ZF1-I型多功能紫外分析儀（上海和勤分析儀器有限公司），KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)A1004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2試藥

樣品：烏芪舒筋通絡(luò)片，規(guī)格：60片/瓶，由肇慶市中醫(yī)院提供（肇慶市中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)），批號(hào)：15050401、15051101、15052401；對(duì)照藥材：細(xì)辛（中國藥品生物制藥檢定所，批號(hào)：121204-200803）、桂枝（中國藥品生物制藥檢定所，批號(hào)：121191-201304）、續(xù)斷（中國藥品生物制藥檢定所，批號(hào)：121103-200806）、牛大力（中國藥品生物制藥檢定所，批號(hào)：121209-0101）；對(duì)照藥品：川續(xù)斷皂苷Ⅵ，僅供測(cè)含量使用，產(chǎn)自中國藥品生物制藥檢定所，批號(hào)：111685-201304；試劑：HPLG級(jí)乙腈、AR級(jí)甲醇、AR級(jí)乙醚、GR級(jí)環(huán)己烷、AR級(jí)正丁醇、GR級(jí)三氯甲烷、石油醚等；硅膠G薄層板，規(guī)格100 mm×200 mm，厚度0.20～0.25 mm（青島海洋化工廠、煙臺(tái)市工業(yè)化學(xué)研究所），水為純化水。

2方法

2.1鑒別方法

2.1.1細(xì)辛的薄層色譜鑒別 取烏芪舒筋通絡(luò)片30片，除去包衣層。用干凈的60 mm研缽研細(xì)后轉(zhuǎn)移到150 ml燒杯中，加甲醇60 ml，超聲預(yù)處理20 min。用快速定性濾紙過濾，濾液真空干燥，殘?jiān)?0 ml水溶解，再加乙醚20 ml在磁力攪拌器上進(jìn)行振搖提取，反復(fù)提取3次，將乙醚提取液混合后蒸干。殘?jiān)稍锖蠹? ml乙酸乙酯，該溶解液作為供試品溶液。取細(xì)辛對(duì)照品精確稱取1 g，加甲醇30 ml，提取方式同細(xì)辛樣品，制成對(duì)照品供試液。

薄層色譜法檢測(cè)方式參照《中國藥典》四部通則0502，分別吸取供試品和對(duì)照品供試溶液各5 μl和4 μl，以硅膠G作固定相，用普通毛細(xì)管將樣品在同一硅膠G薄層板上進(jìn)行點(diǎn)樣，展開劑為正已烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（16∶3∶4）[6]，將點(diǎn)樣后的玻板放入展開缸內(nèi)展開，取出薄層板后晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，于105℃下活化30 min至斑點(diǎn)顯色清晰。用薄層掃描儀對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，供試樣品與對(duì)照品在色譜相應(yīng)的位置上，斑點(diǎn)顏色相同（圖1）。

2.1.2桂枝的薄層色譜鑒別 取本品60片，除去包衣，研細(xì)，加乙醚60 ml，40 KHz條件下超聲1 h。用快速定性濾紙過濾，濾液真空干燥，殘?jiān)? ml乙醇溶解，該溶解液作為供試品溶液。另準(zhǔn)確稱取桂枝對(duì)照品0.5 g，加乙醇30 ml，采用水浴加熱回流方式處理30 min，冷卻后用快速定性濾紙過濾，濾液真空干燥，殘?jiān)?0 ml水溶解，再加乙醚 在磁力攪拌器上進(jìn)行振搖提取，反復(fù)提取3次，將乙醚提取液混合后蒸干，后續(xù)步驟同細(xì)辛提取方式，制成對(duì)照品供試液。

桂枝的薄層色譜法檢測(cè)方式也參照《中國藥典》四部通則0502，分別吸取供試品和對(duì)照品供試溶液5 μl，以硅膠G作固定相，用普通毛細(xì)管將樣品在同一硅膠G薄層板上進(jìn)行點(diǎn)樣，以油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑[7]，將點(diǎn)樣后的薄層板放入展開缸內(nèi)展開，取出薄層板后晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105℃條件下活化30 min至斑點(diǎn)顯色清晰。用薄層掃描儀對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，供試樣品與對(duì)照品在色譜相應(yīng)的位置上，斑點(diǎn)顏色相同（圖2）。

2.1.3牛大力的薄層色譜鑒別 取本品25片，除去包衣，研細(xì)，加濃氨溶液1.5 ml、乙酸乙酯50 ml，40 KHz條件下超聲1 h。用快速定性濾紙過濾，濾液真空干燥，殘?jiān)? ml乙酸乙酯進(jìn)行溶解，該溶解液作為供試品溶液。另準(zhǔn)確稱取牛大力對(duì)照藥材2.0 g，再加0.5 ml濃氨水溶液和30 ml的乙酸乙酯，參照上述細(xì)辛提取方式制成對(duì)照品供試溶液。

牛大力的薄層色譜法檢測(cè)方式也參照《中國藥典》四部通則0502，分別吸取供試品和對(duì)照品供試溶液6 μl，以硅膠G作固定相，用普通毛細(xì)管將樣品在同一硅膠G薄層板上進(jìn)行點(diǎn)樣，環(huán)己烷-乙酸乙酯（20∶3）為展開劑[8]，將點(diǎn)樣后的薄層板放入展開缸內(nèi)展開，取出薄層板后晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃條件下活化30 min至斑點(diǎn)顯色清晰。將薄層板至于365 nm的紫外燈下進(jìn)行檢視，結(jié)果顯示，供試樣品與對(duì)照品在色譜相應(yīng)的位置上，斑點(diǎn)顏色相同（圖3）。

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 本實(shí)驗(yàn)所采用的色譜條件設(shè)定：色譜柱采用AgilentZORBAX-SB-C18（9.4×250，5 μm）；流動(dòng)相采用乙腈-水（28∶72）等度對(duì)樣品進(jìn)行洗脫；柱溫設(shè)定為30℃；流速設(shè)定為1.0 ml/min；進(jìn)樣體積為10 μl；理論塔板數(shù)以川續(xù)斷皂苷Ⅵ計(jì)算，數(shù)值高于3200，波長212 nm。

2.2.2對(duì)照品溶液制備 一定量的川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品，加入甲醇溶液制備成川續(xù)斷皂苷Ⅵ儲(chǔ)備液，濃度為2458.5 μg/ml.精確量取儲(chǔ)備液1 ml于25 ml容量瓶中，加入流動(dòng)相溶液定容至刻度線，充分混合均勻后，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得對(duì)照品供試液，每l ml含98.34 μg川續(xù)斷皂苷Ⅵ。

2.2.3供試品溶液的制備 取烏芪舒筋通絡(luò)片樣品30粒，除去包衣層。用干凈的60 mm研缽研細(xì)后，精確稱取2.0 g樣品于具塞錐形瓶中，加入50 ml甲醇，40 KHz條件下超聲15 min，冷卻后稱量，并用甲醇補(bǔ)至原重量。混均后，用0.45 μl的微孔濾膜進(jìn)行過濾。精確量取25 ml濾液，真空干燥后，加25 ml超純水進(jìn)行溶解，再加水飽和的正丁醇50 ml在磁力攪拌器上進(jìn)行振搖提取，再加30 ml正丁醇反復(fù)提取3次，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次（50 ml，50 ml），再用正丁醇飽和的水洗滌2次（50 ml，50 ml），取正丁醇液，干燥后加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中，定容至刻度線后，混合均勻，用0.45 μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾，濾液備用。

2.2.4陰性對(duì)照樣品溶液的制備 續(xù)斷陰性樣品的制備根據(jù)處方比例和工藝進(jìn)行處理，具體步驟參照“2.2.3供試品溶液的制備”。

2.2.5專屬性試驗(yàn) 分別精確吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性樣品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀進(jìn)行峰面積的測(cè)量，具體的測(cè)量條件設(shè)定參照“2.2.1”（圖4）。提示供試樣品與對(duì)照樣品在同一位置上具有相同的吸收峰，且分離度>1.5，陰性對(duì)照無干擾。

2.2.6線性范圍考察 精密量取3.2項(xiàng)下的貯備液2 ml，分別用乙腈-水（28∶72）混合液稀釋成49.17、78.67、98.34、147.51、196.68 μg/ml的溶液，分別進(jìn)樣10 μl，按3.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)量設(shè)定，以進(jìn)樣量（ng）作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸方程的計(jì)算，得到川續(xù)斷皂苷Ⅵ的回歸方程：y=18 812x-120 283，r=0.9996。提示川續(xù)斷皂苷Ⅵ在491.7～1966.8 ng內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.2.7精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取對(duì)照樣品10 μl，每2.5 h進(jìn)樣一次，重復(fù)進(jìn)樣6次。色譜條件參照“2.2.1“所示，結(jié)果顯示，續(xù)斷皂苷的RSD值為1.16%，提示設(shè)備的精密程度良好。

2.2.8重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為15050401的供試樣品6份，每份2 g。按照“2.2.3”的實(shí)驗(yàn)方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”的色譜條件進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示，6份供試樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均含量為614.1 μg/片，川續(xù)斷皂苷Ⅵ的RSD=0.86%，提示這種方法對(duì)測(cè)量樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量具有良好的重復(fù)性。

2.2.9穩(wěn)定性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取批號(hào)為15050401的同一供試品溶液，在不同時(shí)間梯度（0、2、4、6、8 h）測(cè)定川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示川續(xù)斷皂苷Ⅵ的RSD=2.26%，這也就說明該檢測(cè)方式在8 h內(nèi)測(cè)定有穩(wěn)定的結(jié)果。

2.2.10回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取批號(hào)為15050401的同一供試品1 g，共稱取9份。再準(zhǔn)確量取對(duì)照品儲(chǔ)備液制備成濃度為2458.5 μg/ml的溶液，每3份分別加入該溶液0.5、1、1.5 ml，參照“3.3”方式制備供試品溶液，制備的溶液分別進(jìn)樣10 μl，計(jì)算川續(xù)斷皂苷Ⅵ的回收率，結(jié)果顯示，其平均回收率為101.25%（RSD=1.40%）（表1）。

2.2.11樣品含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取3種不同批號(hào)的烏芪舒筋通絡(luò)片，按“2.2.3”供試品溶液制備方法處理并測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

2.2.12含量限度的制定 根據(jù)上述3批樣品的含量測(cè)定結(jié)果，川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的平均值為2.50 mg/g，每片平均含量為0.625 mg，若允許其含量下浮的幅度≤20%，則含量限度可定為：烏芪舒筋通絡(luò)片每片含川續(xù)斷皂苷Ⅵ≥0.50 mg。因不同產(chǎn)地、不同采收時(shí)間的藥材其川續(xù)斷皂苷Ⅵ成分含量略有差異[9-10]。因此擬定本品每片含川續(xù)斷皂苷Ⅵ≥0.45 mg。

3討論

3.1流動(dòng)相的選擇

根據(jù)中國藥典和文獻(xiàn)記載，筆者曾用流動(dòng)相為乙腈-水（30∶70）[6，11-13]測(cè)定續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ，結(jié)果分離效果不理想，在主峰的后面有一小峰，故將流動(dòng)相稍作改動(dòng)[14]。

3.2提取方法的選擇

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，筆者用加熱回流法[15-16]提取30 min和超聲[17-18]15 min作比較，結(jié)果用HPLC測(cè)定出來的峰面積幾乎一致，超聲提取方法操作簡單，耗時(shí)短，是最佳的選擇。

3.3細(xì)辛、桂枝及牛大力薄層色譜鑒別的方法學(xué)驗(yàn)證

首先進(jìn)行點(diǎn)樣量的考察，以確定供試品取樣量，對(duì)照品溶液和供試品溶液的點(diǎn)樣量；耐用性試驗(yàn)中考察了自制板、煙臺(tái)硅膠G板及青島硅膠G板3種不同的薄層板，以及不同溫度、濕度梯度對(duì)薄層色譜的影響[19-20]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同條件下斑點(diǎn)的Rf值存在差異，但色譜分離良好，斑點(diǎn)清晰，陰性無干擾，提示耐用性好，方法可行。

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