趙敬翠

（遼寧省朝陽(yáng)市建平縣畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 朝陽(yáng) 122400）

β-激動(dòng)劑類藥物，又名β-興奮劑類藥物，俗稱瘦肉精，因具有吸收快的特性，可提高胴體瘦肉率，被廣泛用于飼料中。人食用含有“瘦肉精”的肉或內(nèi)臟，15～20min起作用且維持時(shí)間持久，會(huì)造成群體性的惡性食物中毒，嚴(yán)重的可致人死亡。因此，國(guó)家規(guī)定通過(guò)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)豬肉中β-激動(dòng)劑類藥物為不得檢出。

本文用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)豬肉中β-激動(dòng)劑類藥物的含量，其原理是待測(cè)樣品中的β-激動(dòng)劑類藥物殘留與微孔包被的抗原共同競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體，當(dāng)樣品中β-激動(dòng)劑類藥物含量少時(shí)，更多的抗體就會(huì)與酶標(biāo)板微孔上的抗原結(jié)合而被固定在酶標(biāo)板上，通過(guò)酶催化底物顯色反應(yīng)，顏色為深藍(lán)色；樣品中β-激動(dòng)劑類藥物含量多時(shí)，顏色為淺藍(lán)色。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣品前處理在我縣轄區(qū)內(nèi)屠宰廠隨機(jī)抽取代表性樣品（豬肉）40批次，每個(gè)樣品抽取豬肉200g，精確秤取1±0.01g均質(zhì)后的樣品于50mL離心管中；加入3mL 0.5%三氯乙酸高速渦動(dòng)1min，4000g以上離心5min；取1mL中間層清液于新的離心管中；加40μL 0.5M 氫氧化鈉溶液，渦動(dòng)10s混勻，4000g以上離心5min；立即取40μL檢測(cè)。

1.2 試劑盒β-激動(dòng)劑類酶聯(lián)免疫試劑盒（96孔）。購(gòu)自北京維德維康生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑盒回溫將試劑盒內(nèi)各組份取出置于23～27℃室溫下30min。

1.4 添加陽(yáng)性對(duì)照根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定陽(yáng)性對(duì)照濃度為2ppb，取濃度8.1ppb標(biāo)準(zhǔn)品247.0μL添加到1g空白樣品中，成為濃度2ppb陽(yáng)性對(duì)照品，計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照回收率。處理同前。

2 檢測(cè)步驟

取出酶標(biāo)板，每個(gè)樣品都做雙孔平行，記錄標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照品和樣品位置。

在96孔酶標(biāo)板微孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和其它待測(cè)樣品均為40μL。添加不同樣品時(shí)更換槍頭，防止交叉污染。

再每孔分別加入酶標(biāo)記物工作液60μL。酶標(biāo)記物工作液應(yīng)輕柔混勻后立即用，不能存放。

蓋好蓋板膜，輕輕振蕩10s使之充分混勻，室溫（23～27℃）避光反應(yīng)30min。

揭開(kāi)蓋板膜，倒掉孔中液體，每個(gè)酶標(biāo)板微孔中加入260μL洗滌工作液，充分洗滌4次，每次浸泡15min立即加入底物AB混合液100μL（等比例充分混合，5min內(nèi)使用，液體盛裝、攪拌不能使用金屬物質(zhì)）。

蓋好蓋板膜，輕輕振蕩10s，充分混勻，室溫（23～27℃）下避光反應(yīng)15～20min。

揭開(kāi)蓋板膜，每孔中加入終止液50μL，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻。

終止后5min內(nèi)用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450nm、630nm下讀取酶標(biāo)板吸光度值，并將數(shù)值打印出來(lái)。

3 計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照回收率

利用電腦數(shù)據(jù)分析軟件r-biopharm，手動(dòng)錄入測(cè)得的數(shù)值，軟件自動(dòng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出所有檢測(cè)樣品中β-激動(dòng)劑類藥物的含量?；厥章剩?）=（實(shí)測(cè)陽(yáng)性對(duì)照濃度—實(shí)測(cè)陰性對(duì)照濃度）÷添加濃度（2ppb）×100%，本次檢測(cè)回收率為95%，在75%～105%，說(shuō)明此次檢測(cè)和結(jié)果準(zhǔn)確性高。

4 討論

試劑盒貯存溫度為2～8℃，酶標(biāo)記物常溫下易變性。待測(cè)樣品原則上必須馬上檢測(cè)，如不能及時(shí)檢測(cè)，要將樣品冷凍保存。

加樣時(shí)移液槍應(yīng)垂直于板孔，防止將液體加在孔壁上部；加同種等量液體時(shí)應(yīng)選用多道移液槍，可提高速度，節(jié)省實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格按照避光反應(yīng)溫度和時(shí)間，因?yàn)榭乖c抗體結(jié)合的機(jī)會(huì)不均等，需要一定的時(shí)間和溫度。優(yōu)先與貼近孔壁的一層溶液中的抗原反應(yīng)，是逐步平衡的過(guò)程。

洗板主要靠洗滌使游離的與結(jié)合的酶標(biāo)記物的達(dá)到分離目的。如果洗滌次數(shù)不夠、注入的洗滌液量不足或洗板間隔太久會(huì)直接影響檢測(cè)的結(jié)果，甚至使實(shí)驗(yàn)失敗。另外，洗板后要在亮光處觀察微孔底部是否有氣泡，氣泡可用干凈的槍頭戳破，戳不同孔底的氣泡應(yīng)更換槍頭。

酶聯(lián)免疫法具有快速、靈敏、方便等特點(diǎn)，適用于大批量樣品篩查。而其他檢測(cè)藥物殘留的方法也在逐步完善并應(yīng)用于縣區(qū)檢測(cè)中。