劉柏杉，賀仁忠

世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的最新全球結(jié)核病報(bào)告顯示，2017年全球范圍內(nèi)新發(fā)結(jié)核病患者數(shù)量約為1 000萬(wàn)，其中因結(jié)核病死亡患者數(shù)量約為160萬(wàn)，估計(jì)新發(fā)耐利福平結(jié)核?。≧R-TB）患者數(shù)量約為55.8萬(wàn)，新發(fā)耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）患者數(shù)量約為45.756萬(wàn)；近一半新發(fā)耐藥結(jié)核病患者集中于印度（占24%）、中國(guó)（占13%）、俄羅斯（占10%）。近年來(lái)，隨著一線抗結(jié)核藥物耐藥率逐漸升高，二線抗結(jié)核藥物及新研發(fā)的抗結(jié)核藥物逐漸應(yīng)用于臨床；目前，共有17種抗結(jié)核藥物處于Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段，其中8 種抗結(jié)核藥物為新化合物［1］。

氯法齊明最初主要用于治療麻風(fēng)病，目前，含氯法齊明抗結(jié)核化療方案治療MDR-TB處于Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段［1］，但已有多項(xiàng)研究證實(shí)，多種含氯法齊明二線抗結(jié)核治療方案可能作為治療MDR-TB的標(biāo)準(zhǔn)化組合，并可縮短藥物敏感結(jié)核病及MDR-TB療程，改善患者預(yù)后［2-6］。2010年，VAN等［7］進(jìn)行的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，加替沙星、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、氯法齊明聯(lián)用并于4個(gè)月強(qiáng)化期或痰涂片轉(zhuǎn)陰后加用卡那霉素、丙硫異煙胺、異煙肼（總療程9個(gè)月）可將MDR-TB治療失敗率降低至1%，將復(fù)發(fā)率控制在12%左右。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1993—2011年全球范圍內(nèi)采用含氯法齊明抗結(jié)核化療方案治療MDR-TB的治愈率及有效率＞75%［8］。氯法齊明常見(jiàn)毒副作用以皮膚變黑、胃腸道反應(yīng)為主，嚴(yán)重毒副作用很少見(jiàn)，QT間期延長(zhǎng)亦較為罕見(jiàn)［9-10］。氯法齊明是目前WHO推薦的二線核心抗結(jié)核藥物之一，主要用于治療RR-TB、MDR-TB等，但近年來(lái)結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥現(xiàn)象增多。本文綜述了結(jié)核分枝桿菌耐氯法齊明相關(guān)基因，旨在為結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明的耐藥機(jī)制研究提供參考。

1 作用機(jī)制

目前，氯法齊明的具體作用機(jī)制尚不完全清楚，多數(shù)研究認(rèn)為其作用機(jī)制主要包括以下3個(gè)方面：（1）煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）貢獻(xiàn)電子是結(jié)核分枝桿菌呼吸鏈的初始事件，氯法齊明通過(guò)與重組Ⅱ型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（NDH-2）底物甲基萘醌競(jìng)爭(zhēng)NADH貢獻(xiàn)的電子而產(chǎn)生還原型氯法齊明，隨后被分子氧化并形成超氧化物、過(guò)氧化氫（H2O2），最終通過(guò)釋放活性氧而產(chǎn)生抗結(jié)核分枝桿菌作用［3，11-13］；（2）氯法齊明通過(guò)溶血磷脂介導(dǎo)的膜功能障礙而幾乎完全地抑制K+的吸收，并可能通過(guò)干擾革蘭陽(yáng)性菌、結(jié)核分枝桿菌膜電位而導(dǎo)致其三磷腺苷（ATP）含量降低，因此氯法齊明介導(dǎo)的磷脂酶增強(qiáng)作用可導(dǎo)致抗增殖溶血磷脂分泌增多，進(jìn)而造成K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能障礙并發(fā)揮抗結(jié)核分枝桿菌作用［3，12，14］。（3）氯法齊明能逆轉(zhuǎn)結(jié)核分枝桿菌衍生因子對(duì)吞噬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)殺傷機(jī)制的抑制作用，有助于增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的吞噬作用，且氯法齊明的t1/2較長(zhǎng)、藥代動(dòng)力學(xué)較好［10］。

2 耐藥基因

目前已知的結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥相關(guān)基因包括3種，分別為Rv0678、Rv2535c、Rv1979c。

2.1 Rv0678基因 Rv0678基因ID為888235，全長(zhǎng)498 bp，編碼產(chǎn)物為調(diào)控蛋白。Rv0678屬M(fèi)arR調(diào)控基因之一，廣泛存在于細(xì)菌中，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，如對(duì)抗菌藥物的耐藥性、對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性及毒力因子的調(diào)控等［15］。Rv0678突變是結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥的重要機(jī)制。2015年，ZHANG等［16］通過(guò)對(duì)96株耐氯法齊明結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行全基因組測(cè)序、Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)，97%（93/96）的耐氯法齊明結(jié)核分枝桿菌突變體存在Rv0678突變，其中70%（65/93）的耐氯法齊明Rv0678突變結(jié)核分枝桿菌Rv0678功能失活；該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變熱點(diǎn)，分別為G193和C466T，其中G193突變頻率為43.8%（42/96），主要為刪除/插入突變，而C466T突變頻率為11.5%（11/96）；此外，該研究還發(fā)現(xiàn)C364插入、A202G〔絲氨酸（Ser）68甘氨酸（Gly）〕突變頻率均為5.2%（5/96），其余34個(gè)基因突變散布、無(wú)明顯重疊。2017年，ISLAM等［3］研究證實(shí)，Rv0678突變以G193和C466T突變最為常見(jiàn)（見(jiàn)表1）。

2017年，PANG等［17］以氯法齊明對(duì)結(jié)核分枝桿菌最低抑菌濃度（MIC）＞1 μg/ml為耐氯法齊明結(jié)核分枝桿菌判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥率為5.6%（5/90），其中3株耐氯法齊明結(jié)核分枝桿菌由于53位密碼子突變、1株耐氯法齊明結(jié)核分枝桿菌由于157位密碼子突變而導(dǎo)致氨基酸替換，另1株耐氯法齊明結(jié)核分枝桿菌未發(fā)現(xiàn)基因突變；該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，貝達(dá)喹啉對(duì)這5株耐氯法齊明結(jié)核分枝桿菌的MIC均升高≥4倍，以貝達(dá)喹啉對(duì)結(jié)核分枝桿菌MIC＞0.25 μg/ml為耐貝達(dá)喹啉結(jié)核分枝桿菌判定標(biāo)準(zhǔn)，則其中4株對(duì)貝達(dá)喹啉耐藥。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)兩株結(jié)核分枝桿菌Rv0678基因53位密碼子突變導(dǎo)致Ser53脯氨酸（Pro），氯法齊明對(duì)其MIC為2～4 μg/ml，貝達(dá)喹啉對(duì)其MIC為0.50 μg/ml；1株結(jié)核分枝桿菌Rv0678基因53位密碼子突變導(dǎo)致Ser53亮氨酸（Leu），氯法齊明對(duì)其MIC為2 μg/ml，貝達(dá)喹啉對(duì)其MIC為0.25 μg/ml；1株結(jié)核分枝桿菌Rv0678基因157位密碼子突變導(dǎo)致酪氨酸（Tyr）157天冬氨酸（Asp），氯法齊明對(duì)其MIC為2 μg/ml（見(jiàn)表1）。

綜上所述，Rv0678常見(jiàn)突變類(lèi)型以G193刪除/插入、C466T〔精氨酸（Arg）156終止密碼子〕、A202G（Ser68Gly）、Ser53Pro、Ser53Leu為主，結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥率為5.6%，同時(shí)Rv0678突變可導(dǎo)致貝達(dá)喹啉與氯法齊明交叉耐藥。

2.2 Rv2535c基 因（PepQ基 因） Rv2535c基 因ID為888409，全長(zhǎng)1 119 bp，編碼產(chǎn)物可能是細(xì)胞質(zhì)肽酶。Rv2535c編碼具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白，即a100-aa N-末端α/β結(jié)構(gòu)域和250 kDa C-末端肽酶結(jié)構(gòu)域，推測(cè)Rv2535c編碼Pro特異性氨肽酶并可能優(yōu)先水解氨基酸中位于較大的寡肽末端的Xaa-Pro鍵。2016年，ALMEIDA等［18］研究發(fā)現(xiàn)3株耐氯法齊明結(jié)核分枝桿菌均存在Rv2535c突變，分別為14位密碼子〔丙氨酸（Ala）〕中插入C堿基導(dǎo)致移碼突變、催化結(jié)構(gòu)域中271位密碼子（Arg）中C堿基刪除導(dǎo)致移碼突變、N-末端結(jié)構(gòu)域中非同義單核苷酸突變（Leu44Pro），且貝達(dá)喹啉、氯法齊明對(duì)這3株耐氯法齊明結(jié)核分枝桿菌的MIC升高4～8倍，分別為 0.12～0.25 μg/ml、0.5～1.0 μg/ml（見(jiàn)表 1），證實(shí)Rv2535c突變與結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明、貝達(dá)喹啉耐藥有關(guān)；該研究還指出，廣泛耐藥結(jié)核分離株（X16和X23；北京株系）Rv2535c存在Ser66Pro。2015年，ZHANG等［16］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)氯法齊明耐藥結(jié)核分枝桿菌突變體CT1-5中存在G265T突變，并于Rv2535c基因E89形成終止密碼子（見(jiàn)表1）。

綜上所述，目前研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌Rv2535c突變較少，但可以明確的是Rv2535c突變與氯法齊明耐藥有關(guān)，且Rv2535c突變可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明與貝達(dá)喹啉交叉耐藥。

2.3 Rv1979c基因 Rv1979c基因ID為885819，全長(zhǎng)1 446 bp，編碼產(chǎn)物可能為通透酶。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)氯法齊明耐藥的結(jié)核分枝桿菌突變體CT3-5存在T1052C突變并導(dǎo)致Rv1979c纈氨酸（Val）351Ala，對(duì)氯法齊明耐藥的結(jié)核分枝桿菌突變體存在Rv0678 G193插入、G193刪除同時(shí)出現(xiàn)Rv1979c T1052C（Val351Ala）并可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明的耐藥性升高（MIC＞1 μg/ml）［3，10，16-17］（見(jiàn)表 1）。目前，關(guān)于Rv1979c突變的研究報(bào)道較少，雖可通過(guò)有限的研究資料發(fā)現(xiàn)Rv1979c突變與結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥有關(guān)，但其具體機(jī)制尚不完全清楚，可能與該基因編碼參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的通透酶而直接或間接影響氯法齊明的轉(zhuǎn)運(yùn)或攝取有關(guān)［16］。

3 耐藥機(jī)制

3.1 Rv0678基因 目前研究認(rèn)為，Rv0678基因突變與藥物外排是結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥的主要機(jī)制，其中MMPS5-MMPL5轉(zhuǎn)運(yùn)體是具有重要作用的外排泵。MMPS5與跨膜MMPL5組合形成的通道及MMPS5-MMPL5外排泵復(fù)合體屬耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族（RND），小結(jié)核分枝桿菌膜蛋白（MMPS）常作為輔助性蛋白協(xié)同質(zhì)子依賴(lài)型多藥耐藥泵（MMPL）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及相關(guān)毒力因子。研究表明，MMPS5-MMPL5轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)主要受MARR調(diào)節(jié)劑Rv0678調(diào)控，其開(kāi)放閱讀框位于MPS5-MMPL5操縱子下游［11，15，19］。Rv0678編碼MMPS5-MMPL5外排泵基因的轉(zhuǎn)錄阻遏物，是MMPS5、MMPL5的負(fù)調(diào)控因子；在基因組中，共識(shí)框啟動(dòng)子蛋白回文區(qū)域與Rv0678編碼的MMPS5-MMPL5外排泵基因轉(zhuǎn)錄阻遏物結(jié)合可阻止轉(zhuǎn)錄，Rv0678突變導(dǎo)致MMPS5-MMPL5外排泵基因過(guò)表達(dá)及藥物過(guò)度外排，繼而導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥。外排泵抑制劑如維拉帕米、利血平等可能使氯法齊明、貝達(dá)喹啉對(duì)結(jié)核分枝桿菌的MIC下降，但當(dāng)MIC較高時(shí)外排泵抑制劑敏感性降低，反而對(duì)野生型結(jié)核分枝桿菌的抑制作用更強(qiáng)，其原因可能與體內(nèi)流出物水平與體外不同、不同作用的抗結(jié)核藥物相互作用導(dǎo)致組合體內(nèi)作用喪失等有關(guān)［11，20-23］。

表1 已知的氯法齊明耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)（類(lèi)型）、氨基酸改變及MICTable 1 Known drug resistance related gene mutation site（types）to cycloserine，changes of amino acids and the MIC

3.2 Rv2535c基因 Rv2535c基因突變導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥的機(jī)制與Rv0678較為相似，但確切機(jī)制尚未完全明確。2016年，ALMEIDA等［18］研究表明，細(xì)菌中延長(zhǎng)因子P（EF-P）支持Rv2535c調(diào)節(jié)過(guò)程中以某種方式成熟和/或特定蛋白的更新并維持結(jié)核分枝桿菌的代謝狀態(tài)敏感性，而與Rv0678突變不同的是，Rv2535c突變與MMPL5或MMPS5過(guò)表達(dá)無(wú)關(guān)，Rv2535c突變介導(dǎo)的結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥可能與藥物外流增加、MMPS5-MMPL5轉(zhuǎn)運(yùn)體增加或其他外排調(diào)節(jié)機(jī)制（如防止MMPL5降解）等有關(guān)。

3.3 氯法齊明與貝達(dá)喹啉交叉耐藥 值得關(guān)注的是，多項(xiàng)研究提及氯法齊明與貝達(dá)喹啉具有相同的外排泵底物及耐藥基因（如Rv0678、Rv2535c），因此氯法齊明與貝達(dá)喹啉存在交叉耐藥性，且貝達(dá)喹啉、氯法齊明不會(huì)減少彼此的耐藥性［17-18，20］。有研究表明，基于外排泵的基因突變通常導(dǎo)致較低水平的耐藥性，一般基于外排泵的基因突變導(dǎo)致氯法齊明對(duì)結(jié)核分枝桿菌的MIC是敏感菌株的2～16倍，而基于目標(biāo)基因突變導(dǎo)致氯法齊明對(duì)結(jié)核分枝桿菌的MIC是敏感菌株的16～1 000倍，因此Rv0678、Rv2535c突變所致結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明或氯法齊明與貝達(dá)喹啉交叉耐藥是低水平耐藥［3，18，20］。

3.4 Rv1979c基因 Rv1979c基因突變頻率較低，而Rv1979c突變導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥的具體機(jī)制尚不完全清楚，Rv1979c可能編碼參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的通透酶，因此Rv1979c突變可能通過(guò)直接或間接影響氯法齊明的轉(zhuǎn)運(yùn)或攝取而導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥［16］；此外，Rv1979c突變可與Rv0678突變同時(shí)存在并導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥風(fēng)險(xiǎn)升高。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，目前已知的結(jié)核分枝桿菌耐氯法齊明相關(guān)基因包括Rv0678、Rv2535c、Rv1979c 3種，其中Rv0678突變頻率較高，是結(jié)核分枝桿菌對(duì)氯法齊明耐藥的主要機(jī)制之一。氯法齊明作為WHO推薦的二線核心抗結(jié)核藥物之一，具有獨(dú)特的作用機(jī)制且耐藥率較低、毒副作用較輕，治療MDR-TB的前景廣闊，但其耐藥性不容忽視、耐藥機(jī)制仍有未明確之處，仍需通過(guò)全基因測(cè)序、大樣本量研究等進(jìn)一步探索新的耐藥基因及確切耐藥機(jī)制，為有效防控耐藥結(jié)核病提供參考。