閔文莉,曹喜濤,,季更生,*,屠 潔,,李 強(qiáng),,陳 欣,,張國政,,武國華,

(1.江蘇科技大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院, 鎮(zhèn)江 212018) (2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所, 鎮(zhèn)江 212018)

脂肪酸是最簡單的一種脂,由碳?xì)溲跞N元素組成,是許多更復(fù)雜的脂的組成成分,如細(xì)胞膜上的磷脂為機(jī)體提供能量的甘油三酯等．根據(jù)碳?xì)滏滐柡统潭?脂肪酸可分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸,在生物體的許多生理活動中有著必不可少的作用．脂肪酸及其衍生物主要用于制造日用化妝品、洗滌劑、工業(yè)脂肪酸鹽、生物柴油、油漆、橡膠、肥皂等[1],具有廣泛的應(yīng)用價值．

轉(zhuǎn)錄因子是植物體中環(huán)境脅迫應(yīng)答反應(yīng)所激發(fā)產(chǎn)生的一類蛋白,也稱為反式作用因子,其通過功能結(jié)構(gòu)域與啟動子順式作用元件或其他轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生特異性相互作用以激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄[2-3]．植物中調(diào)控脂肪酸合成與油脂積累的轉(zhuǎn)錄因子有多種,包括WRINKLED1(WRI1)、GmDOF4/GmDOF11、FUSCA3(FUS3)及LEAFY COTYLEDON 1(LEC1)等,而其中的WRI1蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,主要在脂肪酸合成與糖酵解后期發(fā)揮調(diào)控作用[4-6],對植物油脂的合成與積累起到了關(guān)鍵作用．近年來,WRI1蛋白在植物中的研究與應(yīng)用已成為熱點(diǎn)之一,相關(guān)研究表明WRI1可以不同程度地提高作物產(chǎn)油量[7],但是WRI1在微生物中的研究目前還未見報道．本研究通過WRI1轉(zhuǎn)錄因子在真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),分析了擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtWRI1表達(dá)對酵母脂肪酸合成的影響,以期望為未來微生物合成脂肪酸奠定基礎(chǔ)．

1 試驗(yàn)

1.1 材料

(1) 試劑及儀器

擬南芥Arabidopsis thaliana cDNA為本實(shí)驗(yàn)室提取;Taq 酶、DNA連接酶、限制酶、T 載體均購自TAKARA公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、LB 培養(yǎng)基購自生工生物工程(上海)有限公司;參照文獻(xiàn)[8]配制YPD 培養(yǎng)基及SD培養(yǎng)基;脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品從Sigma公司所購．所用儀器:2720 Thermal Cycler PCR 儀;國產(chǎn)DYCP-31E型電泳儀;美國布魯克320GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀．

(2) 引物、質(zhì)粒及菌株

根據(jù)擬南芥WRI1基因Atwri1(GenBank Accession NM-202701)設(shè)計引物,上游、下游引物分別命名為Atwri1-F、Atwri1-R,并分別引入Spe I、BamH I酶切位點(diǎn)(下劃線),引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,序列如表1．大腸桿菌Top10、宿主菌釀酒酵母BY4742、質(zhì)粒p416-MET25為本實(shí)驗(yàn)保存．

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物、質(zhì)粒及菌株

1.2 方法

(1) Atwri1基因的克隆

以擬南芥Atwri1 cDNA為模板,加入引物Atwri1-F、Atwri1-R、Taq酶、dNTPs進(jìn)行PCR擴(kuò)增．反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s;55 ℃ 30 s;72 ℃ 90 s;30個循環(huán);最后72℃延伸10 min．反應(yīng)結(jié)束后以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物并進(jìn)行膠回收．

(2) 構(gòu)建重組T載體pMD18-Atwri1

將T載體及膠回收后的目的基因片段按照一定比例連接,得到的重組T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含氨芐抗生素的LB平板上,37 ℃恒溫過夜培養(yǎng),挑取抗性單克隆菌落培養(yǎng)2～3 h,以pMD18-T載體的上下游通用引物RV-M和M13-47進(jìn)行菌液PCR初步驗(yàn)證．經(jīng)過初步驗(yàn)證后的重組菌株在液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),將菌液送至上海生工測序進(jìn)行最終驗(yàn)證．

(3) 構(gòu)建重組質(zhì)粒p416-Atwri1

將重組大腸桿菌接入液體LB培養(yǎng)基中、37 ℃條件下培養(yǎng)過夜,取過夜培養(yǎng)物分別提取重組T載體、p416-MET25質(zhì)粒,分別進(jìn)行Spe I和BamH I雙酶切反應(yīng),膠回收后Atwri1片段與p416-MET25質(zhì)粒按照一定比例連接,得到的重組質(zhì)粒p416-Atwri1轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含氨芐抗生素的LB平板上,37 ℃恒溫過夜培養(yǎng),挑取抗性單克隆菌落培養(yǎng)2～3 h,以表1中p416-MET25質(zhì)粒引物Atwri1-F/Atwri1-R進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證．

(4) 重組質(zhì)粒p416-Atwri1的轉(zhuǎn)化與鑒定

將上述所得菌株進(jìn)行過夜培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒p416-Atwri1,用LiAc/PEG化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BY4742釀酒酵母中,將重組酵母命名為C-20,涂布于營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)2～3 d,挑取單克隆菌落于液體SD培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至菌液渾濁時取5 μL置于EP管中,加入20 μL 0.02 M NaOH,100℃沸水浴15 min后立即放入冰中,取1 μL作為模板用于PCR驗(yàn)證,同時以轉(zhuǎn)化p416空質(zhì)粒的酵母菌作為空白對照,對照組重組酵母命名為CK-20．

(5) 重組酵母生長曲線的檢測

配制碳濃度為20 g/L的發(fā)酵液,把種子液接入發(fā)酵液中,使發(fā)酵液初始OD600值為0.05[9-10],以空質(zhì)粒重組酵母菌做空白對照,30 ℃、150 r/min培養(yǎng),分別在0、4、10、16、22、28、34、40、46、52和58 h時取樣檢測OD600,根據(jù)OD600和時間作出重組酵母的生長曲線．

(6) 脂肪酸的甲酯化

配制碳濃度為20 g/L的發(fā)酵液,把種子液接入發(fā)酵液中,使發(fā)酵液初始OD600值為0.05,以空質(zhì)粒重組酵母菌做空白對照,30℃、150 r/min培養(yǎng),在96 h時取樣．取20 mL發(fā)酵液,經(jīng)過濃鹽酸破壁后,加入10% HCL-甲醇溶液62℃水浴處理3 h,最終加入正己烷進(jìn)行提取,取正己烷層用于樣品檢測[11]．脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷進(jìn)行溶解,稀釋到10 ppm的濃度,置于-20℃待測．

(7) 脂肪酸的檢測

用氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)檢測重組酵母中脂肪酸的種類及含量,用以評估WRI1轉(zhuǎn)錄因子對釀酒酵母合成脂肪酸的影響,色譜條件如下[12]:毛細(xì)管柱為HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 mm),載氣為高純氦氣(99.999%),進(jìn)樣器溫度280 ℃,離子源溫度200 ℃,載氣流速1.1 mL/min,溶劑延遲時間為3 min,進(jìn)樣量1 μL,程序升溫條件為:初始溫度100 ℃保持4 min,以8 ℃/min 的速度升溫至280 ℃,保持3 min．

通過樣品與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖中峰面積的比對,計算樣品中脂肪酸的含量,計算公式如下:

2 結(jié)果與分析

2.1 Atwri1基因的克隆

以擬南芥cDNA為模板,PCR擴(kuò)增后得到約1 100 bp的片段,電泳圖如圖1,大小與擬南芥WRI1基因預(yù)測值相符, 說明目的基因克隆成功．

圖1 Atwri1基因的電泳圖Fig.1 Electrophoresis map of Atwri1 gene

2.2 重組T載體及重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

Atwri1基因片段插入T載體及表達(dá)載體,進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證及重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證(圖2)．重組T載體經(jīng)DNA測序,所測序列與GenBank序列比對完全一致,說明Atwri1基因擴(kuò)增成功．

圖2 重組質(zhì)粒p416-Atwri1的雙酶切驗(yàn)證Fig.2 Restriction enzyme analysis of therecombinant plasmid p416-Atwri1

2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

將重組質(zhì)粒用PEG/LiAc化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母BY4742中,從平板上挑取的陽性菌落經(jīng)SD培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后,以AtWRI1-F/Atwri1-R為引物進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證,證明了重組質(zhì)粒p416-Atwri1成功轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母,重組菌構(gòu)建成功．

2.4 AtWRI1對重組酵母生長的影響

重組酵母生長曲線如圖3,重組酵母均在34 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期,OD600在5以下,總體菌液濃度之所以不高,可能是由于碳源的快速消耗以及產(chǎn)生了大量乙醇對酵母生長產(chǎn)生了抑制作用．在指數(shù)期,重組酵母明顯比空質(zhì)粒酵母菌生長迅速,可能是由于AtWRI1轉(zhuǎn)錄因子激活了一些與脂肪酸合成和糖酵解有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄[13-15],如β-淀粉酶、?；d體蛋白ACP1等,從而促進(jìn)了重組酵母的生長．

圖3 重組酵母的生長曲線Fig.3 Growth curves of recombinant yeast

2.5 脂肪酸的檢測分析

使用氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測脂肪酸的含量及種類(圖4),在釀酒酵母中過表達(dá)Atwri1基因,脂肪酸的含量及種類均發(fā)生了變化．從色譜圖可以看出,重組酵母與對照菌均主要含有9種脂肪酸,分別為丁酸(C4 ∶0)、辛酸 (8 ∶0)、癸酸(10 ∶0)、肉豆蔻酸 (14 ∶0)、棕櫚酸 (16 ∶0)、棕櫚油酸(16 ∶1)、油酸 (18 ∶1)、硬脂酸 (18 ∶0)、花生酸(20 ∶0),除此之外,僅僅對照菌含有十五烷酸(C15 ∶0),說明WRI1轉(zhuǎn)錄因子改變了菌體合成的脂肪酸種類．

圖4 GC-MS分析釀酒酵母中的脂肪酸Fig.4 GC-MS analysis of fatty acids fromSaccharomyces cerevisiae

與野生菌相比,重組菌p416-Atwri1合成肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸、硬脂酸、花生酸的能力分別為196.3%、38.6%、20.3%、25.9%、95.6%、102%．長鏈脂肪酸的總含量增加了44.8%,長鏈脂肪酸的產(chǎn)量在總脂肪酸產(chǎn)量中所占比例高達(dá)73.8%,高出野生菌33%．

釀酒酵母中合成的主要脂肪酸為C16及C18的飽和及不飽和脂肪酸,如圖5,表達(dá)了WRI1蛋白的酵母C-20合成長鏈脂肪酸的水平均比對照組酵母CK-20有所提高．本實(shí)驗(yàn)未對擬南芥WRI1基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,直接用于酵母中進(jìn)行脂肪酸合成的調(diào)控,另外實(shí)驗(yàn)使用的表達(dá)載體p416-MET為低拷貝質(zhì)粒,拷貝數(shù)有限,使得WRI1蛋白的表達(dá)量在一定程度上受到限制,但仍可看出WRI1蛋白調(diào)控脂肪酸合成的潛力．

圖5 重組酵母中脂肪酸的合成水平Fig.5 Fatty acids production levels in therecombination Saccharomyce. cerevisiae

3 結(jié)論

合成生物學(xué)方法構(gòu)建高產(chǎn)脂肪酸微生物成為熱點(diǎn)之一,已有在大腸桿菌中構(gòu)建脂肪酸合成通路的報道[17],但大腸桿菌表達(dá)體系有些不足之處,如表達(dá)蛋白往往缺乏修飾,不宜表達(dá)真核基因;蛋白后期處理成本增加;很難表達(dá)大量可溶性蛋白等．而釀酒酵母作為真核模式生物,有效地避開原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn),并且由于其基因組已知、代謝背景清晰、耐酸堿、易于培養(yǎng)等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),WRI1轉(zhuǎn)錄因子在釀酒酵母中的研究應(yīng)用可為獲得高量生產(chǎn)脂肪酸的微生物菌株奠定基礎(chǔ)．

本實(shí)驗(yàn)首次在釀酒酵母中成功表達(dá)了植物轉(zhuǎn)錄因子,提高了長鏈脂肪酸的含量,有利于工業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)油脂．在釀酒酵母中表達(dá)擬南芥WRI1基因?yàn)檎{(diào)控脂肪酸合成做鋪墊,后續(xù)實(shí)驗(yàn)會繼續(xù)著重于提高釀酒酵母中脂肪酸的合成,除了代謝改造外,還可克隆油料作物(如大豆)中的WRI1基因并應(yīng)用于釀酒酵母,以及利用WRI1蛋白與綠色熒光蛋白(GFP)的融合表達(dá)對重組酵母中的WRI1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行細(xì)胞定位及功能分析．油料作物中的WRI1蛋白對脂肪酸的合成與油脂積累起到了關(guān)鍵作用,若能在微生物中成功運(yùn)用,將使微生物菌株得到更廣泛地應(yīng)用．