鄒飏 ，李浩 ，尚江蔭子 ，雙 峰 ，魏志遠(yuǎn) ，單記春

青 藤 堿 (9α，13α，14α -7，8-Didehydro-4-hydroxy-3，7-dimethoxy-17-methylmorphinan-6-one，Sinomenine)是從傳統(tǒng)中藥青風(fēng)藤（Caulis sinomenii）中提取的一種生物活性成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制、降壓、抗心律失常等多種生物活性[1]。臨床已有使用的青藤堿類藥物有正清風(fēng)痛寧片、鹽酸青藤堿注射液、毛青藤總堿片等制劑，主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)制性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病[2]，近年來也有此類藥物用于治療慢性腎炎、抗氧化、抗腫瘤的文獻(xiàn)報(bào)道[3-7]。

骨保護(hù)素（OPG）又稱為破骨細(xì)胞抑制因子，是腫瘤壞死因子受體超家族中的一員，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能直接下調(diào)破骨細(xì)胞功能的因子。RANKL（細(xì)胞核因子受體活化因子配體)是腫瘤壞死因子超家族中的一員，其主要由成骨細(xì)胞和骨基質(zhì)分泌，RANKL能與破骨細(xì)胞表面的RANK（細(xì)胞核因子受體活化因子）結(jié)合，從而刺激破骨細(xì)胞分化和成熟、啟動(dòng)破骨細(xì)胞的骨質(zhì)吸收作用，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞凋亡[8，9]。體外方面，青藤堿抑制RANKL誘導(dǎo)的0Cs骨吸收活性并降低相關(guān)破骨方面的指標(biāo)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示青藤堿抑制RANKL誘導(dǎo)的NF-κB信號通路，同時(shí)促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的成熟OCs凋亡[10]。但青藤堿對成骨細(xì)胞相關(guān)的研究并未見報(bào)道，就此我們展開青藤堿對成骨細(xì)胞方面的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3E1細(xì)胞株（購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院），胎牛血清（FBS）（公司），DMED 培養(yǎng)液（Hyclone 公司），抗壞血酸 （sigma公司），β-甘油酸磷酸鈉 （sigma公司），地塞米松（sigma 公司），青霉素/鏈霉素（sigma公司），DMSO（sigma公司）鹽酸青藤堿（大連美侖生物技術(shù)有限公司質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：＞98%），MTT（sigma公司），堿性磷酸酶測定試劑盒（可見光比色法）（南京建成），RNA 抽提液（TaKaRa公司），RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （TaKaRa公司），RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司）β-actin（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），OPG RabbitAnti（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），RANKLRabbitAnti（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），Primer（金斯瑞生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并常規(guī)換液。

1.2.2 分組和給藥方法 青藤堿溶解于DMSO，稀釋濃度為80mmol/L的溶液過濾4°儲(chǔ)存?zhèn)溆?，空白對照組濃度為0mmol/L（A組），實(shí)驗(yàn)組終濃度為0.25、0.5、1mmol/L（B、C、D 組）。 24h 后更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液 (含10%胎牛血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入10－8mmol/L地塞米松、50mg/L抗壞血酸、10mmol/Lβ－甘油磷酸鈉)，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度青藤堿成骨誘導(dǎo)液，對照組加入不含青藤堿的等量成骨誘導(dǎo)液，每2-3d更換培養(yǎng)液1次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)3周。

1.2.3 MTT增殖實(shí)驗(yàn) 24孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞，24h后換液，空白對照組加入0mmol/L青藤堿培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加 0.25、0.5、1、2、4、8、16mmol/L 含青藤堿的培養(yǎng)基，每種濃度各設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。在加入受試藥72h后，每孔加入新鮮誘導(dǎo)液200μl和MTT 溶液(5mg/ml用 PBS(pH=7.4)配)20μl，混勻后置于37℃、5%CO2孵箱孵育4-6h，終止培養(yǎng)，小心吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加 150μl DMSO，震蕩10min，將待測樣品移至96孔板培養(yǎng)板，選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，取3孔平均值。

1.2.4 堿性磷酸酶活性測定 細(xì)胞按5×103個(gè)/ml密度接種于96孔板，24h后換液，空白對照組加入0mmol/L青藤堿培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加0.25、0.5、1mmol/L含青藤堿的培養(yǎng)基，每種濃度各設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。在加入受試藥7d后，棄培養(yǎng)液，每孔加入1%Trixon-100，并放入4℃冰箱1h裂解細(xì)胞。1h后各孔取50μl細(xì)胞裂解液，根據(jù)ALP試劑盒的說明在520nm處檢測各孔的吸光度值。經(jīng)公式：（測定孔吸光度值-空白孔吸光度值）（標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度值/-空白孔吸光度值）×酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷待測樣本蛋白濃度，得出每孔堿性磷酸酶的含量。

1.2.5 RT-PCR檢測OPG RANKL轉(zhuǎn)錄水平 將MC3T3-E1細(xì)胞種于6孔板內(nèi)，空白對照組加入0mmol/L青藤堿培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加0.25、0.5、1mmol/L含青藤堿的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h。Trizol法提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄（RT reagent Kit TaKaRa）SYBR Green 分 析 法 得 到cDNA。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：。OPG引物序列：上游引物5-AGGAACTGCAGTCCGTGAAG-3；下游引物5-ATTCCACACTTTTGCGTGGC-3；擴(kuò)增片段長度328bp。RANKL引物序列：上游引物5-AGGCTCATGGTTGGATGTGG-3；下游引物 5-GTCTGTAGGTACGCTTCCCG-3；擴(kuò)增片段長度259bp。GAPDH引物序列：上游引物5-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3；下游引物 5-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3；擴(kuò)增片段長度129bp。每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。PCR的循環(huán)條件94℃預(yù)變性 4min，95℃變性 30s，58℃退火 20s，72℃延伸30s，38 次循環(huán)，最后 95℃ 1min，55℃ 1min。 做熔解曲線分析。

1.2.6 Western Blot檢測OPG、RANKL蛋白的表達(dá)按全蛋白抽提試劑盒說明書提取處理24h后的各組細(xì)胞總蛋白，并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。－20℃保存。取各組MC3T3-E1細(xì)胞樣本70μg，進(jìn)行SDSPAGE聚丙烯胺凝膠電泳，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，4℃封閉，過夜后按約0.1ml/cm2的量加入封閉液和適量一抗抗體OPG RANKL(1∶1000)搖床搖蕩孵育(4℃，過夜)。TBST 漂洗濾膜 4次，每次10min。將膜與HRP結(jié)合的二抗(二抗用封閉液稀釋1∶2000)室溫下?lián)u蕩孵育2h，然后用TBST充分洗膜，漂洗4次，每次10min。掃描儀掃描膠片，分析軟件對掃描所得圖像進(jìn)行分析，將灰度值以 ODOPG/ODβ-actin、ODRANKL/ODβ-actin分別進(jìn)行OPG、RANKL蛋白分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組定量檢測數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖情況 加藥72h后加藥組均可促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖，且0.25、0.5mmol/L組OD值顯著升高，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。表明一定濃度的青藤堿對MC3T3-E1成骨細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用。

2.2 堿性磷酸酶活性測定 培養(yǎng)第7d時(shí)，相對于空白對照組，不同濃度青藤堿誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠前成骨細(xì)胞向成骨分化，其中以B組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 RT-PCR測定成骨細(xì)胞基因OPG、RANKL表達(dá) 在成骨細(xì)胞基因OPG、RANKL的mRNA表達(dá)檢測中，相對于空白對照組，B、C組濃度成骨細(xì)胞內(nèi)OPGmRNA表達(dá)均增高，RANKLmRMA表達(dá)均較對照組減低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 Weatern-blot測定成骨細(xì)胞基因OPG、RANKL蛋白的表達(dá) 在成骨細(xì)胞基因OPG、RANKL的蛋白表達(dá)檢測中，相對于空白對照組，B、C組濃度成骨細(xì)胞內(nèi)OPG蛋白表達(dá)均增高，RANKL蛋白表達(dá)均較對照組減低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

骨是一個(gè)代謝活躍的器官，其中骨量的維持是由兩個(gè)對立統(tǒng)一的系統(tǒng)所控制：破骨細(xì)胞所介導(dǎo)的骨吸過程與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨基質(zhì)合成過程。這兩個(gè)過程在整個(gè)生命周期中都在進(jìn)行連續(xù)的更新與改建。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、相關(guān)物質(zhì)的分泌和骨組織礦化。健康人體內(nèi)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)量維持在相對平衡狀態(tài)以維持正常骨量。一旦破骨細(xì)胞的數(shù)量與成骨細(xì)胞的數(shù)量打破了相對平衡，就會(huì)導(dǎo)致包括骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的諸多骨病[11]。

青藤堿是從防己科植物青風(fēng)藤及毛青藤的干燥藤莖提取的單體生物堿，有研究發(fā)現(xiàn)青藤堿可緩解骨破壞進(jìn)程發(fā)展[12，13]。同時(shí)，青藤堿能抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠急性顱骨骨破壞模型的OCs活化并降低 TNF-α 水平[14，15]，而在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠血清中，青藤堿能夠提高外周血OPG/RANKL比值，提示青藤堿對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有骨保護(hù)作用[16]。上述研究已表明青藤堿可以通過OPG/RANKL/RANK信號通路影響破骨細(xì)胞活性。

OPG作為內(nèi)源性拮抗RANKL的蛋白為被認(rèn)為有較強(qiáng)的骨保護(hù)功能，其含量的高低提示骨破壞活動(dòng)的強(qiáng)弱，OPG蛋白及OPGmRNA含量升高提示OPG表達(dá)升高，其抑制破骨細(xì)胞的分化及激活的能力加強(qiáng)，最終導(dǎo)致骨重吸收活動(dòng)調(diào)低；相應(yīng)的RANKL蛋白表達(dá)及RANKLmRNA含量降低提示RANKL表達(dá)降低，其促進(jìn)破骨細(xì)胞分化及激活的能力受抑制，最終導(dǎo)致骨吸收活動(dòng)受抑制[17，18]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，含有低中濃度青藤堿誘導(dǎo)液培養(yǎng)的前成骨細(xì)胞內(nèi)，其OPG蛋白較對照升高，RANKL蛋白含量較對照組減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；此外，這兩組含青藤堿藥物組較對照及其他藥物組可增加OPGmRNA、減低RANKLmRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。上述研究結(jié)果提示：青藤堿可刺激成骨細(xì)胞分泌OPG增多，并且抑制成骨細(xì)胞分泌RANKL，一方面起骨保護(hù)作用，另一方面結(jié)合其抑制破骨活性的效果，使青藤堿在以后有望成為一種抗骨質(zhì)疏松的作用藥物。

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