李 媛，史 冊(cè)，張 雪，趙 歡，郝新青，胡 月，劉蒼維，周怡君

閆廣興2,3，張穎麗1，孫宏晨2,3

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，吉林 長春 130021；2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科，吉林 長春 130021)

牙發(fā)育是一個(gè)連續(xù)的過程，根據(jù)形態(tài)變化可分為蕾狀期、帽狀期和鐘狀期3個(gè)時(shí)期。分化成熟的具有分泌功能的成牙本質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞器主要分布于分泌端胞漿內(nèi)，呈高柱狀排列，這種形態(tài)及功能上不對(duì)稱分布稱為成牙本質(zhì)細(xì)胞的極化[1]。細(xì)胞的極性[2]是某些胞質(zhì)成分不對(duì)稱，這種特定的空間分布會(huì)促進(jìn)不同的細(xì)胞行為，如分化、局部細(xì)胞膜增長、免疫系統(tǒng)激活、定向細(xì)胞遷移和分子的跨膜運(yùn)輸。對(duì)于哺乳動(dòng)物，上皮細(xì)胞是研究細(xì)胞極性形成的典型模型，其極性的建立需要細(xì)胞連接作為外在啟動(dòng)信號(hào)，最終形成頂?shù)讟O性 (apical-basal polarity，A-B極性)[3]。在A-B極性形成的過程中，細(xì)胞連接的形成作為極性信號(hào)，指導(dǎo)PAR極性復(fù)合體定位于細(xì)胞頂端[4]。PAR極性復(fù)合體由PAR3、PAR6與aPKC組成，可與Rho GTPase信號(hào)相互作用，參與極性的維持和調(diào)控[5]。PAR極性復(fù)合體成員之一的PAR3還參與細(xì)胞連接的形成[6]。CDC42作為Rho家族的一員，不僅參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移和偽足形成等 ，還參與極性復(fù)合物的形成，是細(xì)胞極化的中心，并調(diào)控多種極性形成的信號(hào)通路[7-9]。然而，關(guān)于CDC42和PAR3在牙發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)及其對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞與成釉細(xì)胞極性作用的相關(guān)研究較少。本研究通過對(duì)小鼠牙發(fā)育期不同階段的牙胚(蕾狀期、帽狀期、鐘狀早期和鐘狀晚期)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察CDC42和PAR3在牙胚發(fā)育過程中的表達(dá)，初步探討其在成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞極性形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性C57小鼠10只，體質(zhì)量約20 g；成年雌性C57小鼠20只，體質(zhì)量約24 g；均購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(清潔級(jí))，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)2013-0001。所有小鼠狀況良好，無系統(tǒng)性疾病。

1.2 主要試劑和儀器15% EDTA脫鈣液和4%多聚甲醛(北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司)，兔抗小鼠CDC42單克隆抗體(美國Abcam公司)，兔抗小鼠PAR3多克隆抗體(美國Proteintech公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒(KIT-9706，福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，DAB(ZLI-9019，北京中杉金橋生物科技有限公司)。 切片機(jī)，體視顯微鏡(SZX16)和電子顯微鏡(Vanox)(日本Olympus公司)。

1.3 標(biāo)本制備及處理1只雄性小鼠與2只雌性小鼠合籠，次日上午觀察陰栓，以查到陰栓當(dāng)天記為胚胎0.5 d(embryonic day 0.5，E0.5)。胚胎小鼠發(fā)育至13.5、14.5、16.5和18.5 d(E13.5、E14.5、E16.5和E18.5)，取孕鼠脫頸處死后，取出子宮，于體式顯微鏡下分離小鼠胚胎，取小鼠頭部，4%多聚甲醛4℃固定24 h，乙醇梯度脫水，過二甲苯，標(biāo)本透明，浸蠟、包埋。取出生后1 d(postnatal day 1，PN1)和出生后5 d(PN5)的小鼠頭部，4%多聚甲醛4℃固定24 h，15% EDTA脫鈣1周，脫水、浸蠟、包埋。

1.4 HE染色制備E13.5、E14.5、E16.5、E18.5、PN1和PN5小鼠下頜第一磨牙牙胚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察小鼠牙胚蕾狀期(E13.5)、帽狀期(E14.5)、鐘狀早晚期(E16.5和E18.5)組織形態(tài)表現(xiàn)以及PN1和PN5小鼠牙冠發(fā)育情況。

1.5 免疫組織化學(xué)染色切片烤片1 h后，常溫下脫蠟至水，PBS沖洗3 min×3次，EDTA(pH9.0)修復(fù)液微波修復(fù)，PBS沖洗3 min×3次，滴加3% H2O230 min，PBS沖洗3 min×3次；羊血清封閉30 min后加一抗，分別為兔抗鼠CDC42單克隆抗體和PAR3多克隆抗體，4℃過夜；PBS沖洗5 min×3次；滴加羊抗兔生物素標(biāo)記二抗(北京中杉)10 min，PBS沖洗5 min×3次；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素抗生物素工作液，常溫20 min，PBS沖洗5 min×3次；滴加新鮮配置的DAB顯色液鏡下顯色，終止后蘇木素復(fù)染，樹膠封片。鏡下觀察并拍照?？瞻讓?duì)照以PBS代替一抗。

2 結(jié) 果

2.1 不同時(shí)間小鼠胚胎圖像體式顯微鏡下不同時(shí)間小鼠胚胎圖像見圖1(插頁二)。

2.2 蕾狀期、帽狀期和鐘狀早期小鼠牙胚組織形態(tài)表現(xiàn)及CDC42和PAR3的表達(dá)E13.5是小鼠牙胚發(fā)育的蕾狀期。HE染色：牙板上皮向間充質(zhì)處延伸，形成上皮芽，形狀類似于花蕾，是成釉器的始基。在上皮芽周圍外胚間充質(zhì)處細(xì)胞增生，包繞著上皮芽(圖2A和B，見插頁二)。免疫組織化學(xué)染色：CDC42在口腔上皮與外胚間充質(zhì)處均有較為廣泛的表達(dá)，在上皮芽及其周圍的外胚間充質(zhì)處表達(dá)較多(圖2C，見插頁二)。PAR3在上皮芽及其周圍外胚間充質(zhì)處有少量表達(dá)(圖2D，見插頁二)。

E14.5是小鼠牙胚發(fā)育的帽狀期。HE染色：牙蕾向外胚間充質(zhì)處生長，周圍外胚間充質(zhì)細(xì)胞密度增加，此時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞的分化，成釉器分化為3層細(xì)胞，包括外釉上皮、內(nèi)釉上皮和星網(wǎng)狀層(圖2E和F，見插頁二)。免疫組織化學(xué)染色：CDC42于口腔黏膜上皮、外釉上皮、內(nèi)釉上皮、星網(wǎng)狀層細(xì)胞的胞漿及外胚間充質(zhì)均有表達(dá)(圖2G，見插頁二)。PAR3在口腔黏膜上皮和外胚間充質(zhì)均有表達(dá)，在成釉器的外釉上皮、內(nèi)釉上皮及星網(wǎng)狀層的胞漿有少量表達(dá)(圖2H，見插頁二)。

E16.5是小鼠牙發(fā)育的鐘狀早期。HE染色：成釉器體積進(jìn)一步變大，成釉器進(jìn)入成熟期，分化為4層，分別為外釉上皮層、內(nèi)釉上皮層、中間層和星網(wǎng)狀層。內(nèi)釉上皮與外釉上皮在頸環(huán)處增生，向間充質(zhì)處嵌入性增長，在未來牙尖頂部還可見釉結(jié)(圖2I和J，見插頁二)。免疫組織化學(xué)染色：CDC42在外釉上皮與內(nèi)釉上皮胞漿處高表達(dá)，星網(wǎng)狀層和牙乳頭細(xì)胞胞漿也有表達(dá)(圖2K，見插頁二)。PAR3在外釉上皮、內(nèi)釉上皮、牙乳頭和星網(wǎng)狀層細(xì)胞胞漿處有表達(dá)(圖2L，見插頁二)。

2.3 鐘狀晚期小鼠牙胚組織形態(tài)表現(xiàn)及CDC42和PAR3的表達(dá)E18.5是小鼠牙發(fā)育的鐘狀晚期。HE染色：內(nèi)釉上皮細(xì)胞向前成釉細(xì)胞分化(圖3A和B，見插頁二)。免疫組織化學(xué)染色：CDC42在內(nèi)釉上皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)強(qiáng)于其在牙乳頭細(xì)胞的表達(dá)(圖3C和D，見插頁二)。PAR3表達(dá)于內(nèi)釉上皮與牙乳頭細(xì)胞胞漿，并且PAR3在內(nèi)釉上皮中的表達(dá)強(qiáng)于牙乳頭(圖3E和F，見插頁二)。

PN1仍處于小鼠牙發(fā)育鐘狀晚期。HE染色：分化的成釉細(xì)胞與成牙本質(zhì)細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞與成釉細(xì)胞為高柱狀，呈柵欄狀緊密排列，此時(shí)有前期牙本質(zhì)形成(圖4A和B，見插頁二)。免疫組織化學(xué)染色：CDC42表達(dá)于成牙本質(zhì)細(xì)胞及成釉細(xì)胞的分泌端，在牙乳頭處的表達(dá)較成牙本質(zhì)細(xì)胞處減少(圖4C和D，見插頁二)。PAR3在成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌端表達(dá)較高，在星網(wǎng)狀層以及牙乳頭細(xì)胞胞漿中也有少量表達(dá)(圖4E和F，見插頁二)。

PN5時(shí)，HE染色:小鼠上皮根鞘開始向根方延伸，已有釉質(zhì)和牙本質(zhì)形成，成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞呈高柱狀緊密排列(圖5A和B，見插頁三)。免疫組織化學(xué)染色：CDC42在成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌端表達(dá)較高(圖5C和D，見插頁三)，PAR3在成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞分泌端表達(dá)較弱(圖5E和F，見插頁三)。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：CDC42在小鼠牙胚發(fā)育的整個(gè)過程均有表達(dá)，同時(shí)在小鼠口腔黏膜上皮與周圍的外胚間充質(zhì)等處均有不同程度的表達(dá)，該結(jié)果與張文菲等[10]研究結(jié)果基本一致。牙發(fā)育起始階段中重要的細(xì)胞生物學(xué)行為之一是細(xì)胞的增殖[11]。CDC42通過其下游分子鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFT)誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖[12]。CDC42表達(dá)于蕾狀期、帽狀期和鐘狀早期牙胚且在以上各期上皮處表達(dá)量較間充質(zhì)處高，其可能參與了早期牙發(fā)育過程中上皮細(xì)胞向間充質(zhì)處的增殖和遷移。研究[13]表明：CDC42參與了上皮細(xì)胞黏附連接與緊密連接的形成 。在鐘狀晚期，前成釉細(xì)胞排列緊密，內(nèi)釉上皮向前成釉細(xì)胞分化，CDC42表達(dá)于內(nèi)釉上皮細(xì)胞的胞漿，并且CDC42于此期的表達(dá)弱于鐘狀早期牙胚表達(dá)，推測(cè)CDC42可能主要參與了鐘狀晚期牙胚內(nèi)釉細(xì)胞連接的形成，此期上皮細(xì)胞的增殖遷移減弱。CDC42表達(dá)于PN1和PN5小鼠牙胚的呈高柱狀極化形態(tài)的成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞分泌端，并且其表達(dá)強(qiáng)于E18.5小鼠。細(xì)胞極性的建立包括細(xì)胞連接的建立與極性復(fù)合物的形成[14]，出生后小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞分泌端有緊密連接相關(guān)蛋白定位[15],CDC42還參與極性復(fù)合物的形成[13]，CDC42作為極性相關(guān)蛋白于此期表達(dá)增強(qiáng)，表明其可能對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞極性建立有重要作用。

極性分子PAR活化會(huì)引起一系列細(xì)胞效應(yīng)，如遷移細(xì)胞頭尾軸的形成、細(xì)胞的不對(duì)稱分裂以及上皮細(xì)胞頂?shù)讟O性的建立等。本研究結(jié)果顯示：PAR3參與小鼠牙胚發(fā)育的整個(gè)過程。在牙胚發(fā)育蕾狀期，上皮芽增殖能力較強(qiáng)尚未出現(xiàn)細(xì)胞分化[16]，PAR3在上皮芽處表達(dá)較低；在帽狀期與鐘狀早期，PAR3在成釉器的外釉上皮以及內(nèi)釉上皮處表達(dá)較蕾狀期高。在鐘狀晚期，PAR3在前成釉細(xì)胞表達(dá)但其表達(dá)明顯弱于其在鐘狀晚期時(shí)的表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞呈高柱狀排列緊密，由于PAR3還參與極性復(fù)合物的形成[5]和細(xì)胞連接的建立[6]。本文作者推測(cè)：PAR3在此期的表達(dá)可能參與了前成釉細(xì)胞細(xì)胞連接的建立及其極性復(fù)合物的形成。PN5小鼠牙胚成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞分泌端PAR3表達(dá)與出生后PN1其表達(dá)量接近，細(xì)胞頂端連接復(fù)合體定位于此，PAR3對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞極性的建立可能發(fā)揮重要作用。

綜上所述，細(xì)胞極性相關(guān)分子CDC42和PAR3表達(dá)于小鼠牙胚發(fā)育的整個(gè)過程。在牙胚發(fā)育的早期階段，CDC42和PAR3可能參與了細(xì)胞的增殖；在牙胚發(fā)育的晚期階段，從前成釉細(xì)胞開始到成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞極性形成，CDC42與PAR3可能參與了成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞的極性建立。但關(guān)于CDC42與PAR3在牙胚發(fā)育過程中增殖和細(xì)胞極性形成中的具體作用及其分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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