何成山綜述 馬晨蕓， 陸志成審校

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233000；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，上海 200137）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球公共衛(wèi)生的重要問(wèn)題。每年全球由HBV感染相關(guān)的急慢性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞性肝癌等導(dǎo)致的死亡人數(shù)達(dá)78.6萬(wàn)[1]。全球有超過(guò)2.4億人為慢性乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）攜帶者[2]，亞太地區(qū)為高度流行區(qū)。HBV感染引起的乙型病毒性肝炎（簡(jiǎn)稱乙肝）是重要的傳染病之一。我國(guó)HBV感染流行率為34.28%，1～59歲人群HBsAg陽(yáng)性率為7.18%，由此推算我國(guó)目前有近5億人感染過(guò)HBV，HBsAg攜帶者約9 300萬(wàn)[3]，是世界上HBsAg攜帶人口最多的國(guó)家。HBsAg是HBV的外蛋白，可以存在于感染者的血液、體液和分泌物中，是重要的病毒學(xué)血清標(biāo)志物，臨床上常將其作為評(píng)估HBV感染和抗病毒治療反應(yīng)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。同時(shí)，HBsAg還是輸血安全的關(guān)鍵篩查指標(biāo)。目前，我國(guó)HBV DNA檢測(cè)尚未完全開展，HBsAg檢測(cè)的敏感性和特異性決定著我國(guó)輸血后乙肝的發(fā)生率。

HBV基因型根據(jù)S區(qū)核苷酸序列異源性主要分為8個(gè)基因型，即A、B、C、D、E、F、G和H型，其基因組含4個(gè)部分重疊的開放閱讀讀碼框，即編碼外膜蛋白的前S/S區(qū)（Pre-S/S區(qū)）、編碼核衣殼蛋白的前C/C區(qū)、編碼DNA聚合酶的P區(qū)和編碼X蛋白的X區(qū)。Pre-S/S區(qū)編碼大（L）、中（M）和?。⊿）3種表面蛋白。S蛋白包含226個(gè)氨基酸，即HBsAg；M蛋白包含S蛋白和55個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的pre-S2蛋白，L蛋白包含M蛋白和108～119個(gè)氨基酸的Pre-S1蛋白。在HBV基因組中，Pre-S/S區(qū)基因在所有開放閱讀框中具有較高的突變率，其中主要核心親水區(qū)域（major hydrophilic region，MHR）內(nèi)“α”決定簇（氨基酸位點(diǎn)124～147）基因序列的突變更為常見。目前，大多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為S蛋白中的“α”決定簇是HBsAg具有免疫原性的區(qū)域[4]，其中“α”決定簇的第2個(gè)環(huán)是HBsAg的主要抗原決定簇[5]。編碼“α”決定簇基因序列的上游和內(nèi)部往往存在多位點(diǎn)突變和氨基酸替代，均可引起抗原構(gòu)象變化，影響中和抗體的識(shí)別。Pre-S/S蛋白突變也會(huì)影響病毒的分泌和穩(wěn)定性，導(dǎo)致循環(huán)中病毒量出現(xiàn)低水平。由于上述原因，Pre-S/S區(qū)突變會(huì)影響體內(nèi)HBV的清除，從而影響機(jī)體免疫反應(yīng)，使HBV產(chǎn)生免疫逃逸現(xiàn)象，同時(shí)還會(huì)干擾體外診斷試劑的檢測(cè)。因此，研究和分析HBV病毒株S區(qū)基因MHR常見的突變類型，對(duì)于HBV疫苗的研制、乙肝的預(yù)防和治療監(jiān)測(cè)、輸血的安全性等都有重要意義。

1 我國(guó)HBV S區(qū)基因組MHR常見的突變及氨基酸替換

HBV S區(qū)基因組MHR編碼的“α”決定簇富含半胱氨酸，由C124和C137、C139和C147兩兩間的二硫鍵形成2個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)，共同維持著HBsAg的構(gòu)象結(jié)構(gòu)和抗原性。因此，發(fā)生在“α”決定簇的單個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變均可能導(dǎo)致HBsAg的構(gòu)象和抗原性發(fā)生改變。世界各地已廣泛報(bào)道，慢性乙肝患者感染的HBV常在MHR出現(xiàn)突變，形成突變逃逸株。然而，突變的頻率在各個(gè)國(guó)家不盡相同。在我國(guó)，MHR的突變率同樣存在明顯的地域性差異。LI等[6]對(duì)我國(guó)廣東省東莞地區(qū)HBV感染患者M(jìn)HR變異導(dǎo)致的氨基酸替換進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)391例慢性HBV感染者中91例存在MHR的氨基酸替換（突變率為24.6%），其中在“α”決定簇內(nèi)的有48例（突變率為52.7%），發(fā)生突變的主要位點(diǎn)為S126、S100、S101、S133、S145、S120、S129。SHI等[7]調(diào)查了我國(guó)華北地區(qū)HBV流行株S基因MHR突變率，發(fā)現(xiàn)HBV基因MHR的總體突變頻率為46.6%，顯著高于LI等[6]的研究結(jié)果；其中突變頻率高的位點(diǎn)有Q10I（29.9%）、I126T（70.6%）。I126T突變是HBV的C基因型獨(dú)有的，且頻發(fā)于我國(guó)HBV感染患者。該位點(diǎn)位于“α”決定簇第1個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)，其氨基酸改變會(huì)導(dǎo)致抗原性的改變，并使HBV毒力增強(qiáng)，這與美國(guó)和西歐國(guó)家的HBV變異發(fā)生模式和發(fā)生類型不同。一項(xiàng)由我國(guó)23家醫(yī)院參與的臨床研究納入230例未經(jīng)治療的HBV基因型均為C的乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）陽(yáng)性患者，結(jié)果顯示僅有16.96%的患者感染的HBV S區(qū)基因無(wú)突變，有83.04%的患者HBV S區(qū)基因出現(xiàn)1個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的突變；這些點(diǎn)突變主要位于“α”決定簇，突變類型有S117T、K122R、I126N/S/T和G145R；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)一些罕見報(bào)道的突變位點(diǎn)，如E2G、L21S等；低HBsAg水平患者S區(qū)基因突變的頻率顯著高于高HBsAg水平的患者[8]。DING等[9]的研究結(jié)果顯示，大約有4.9%的慢性乙肝患者血清中HBsAg和乙型肝炎表面抗體（hepatitis B surface antibody，HBsAb）同時(shí)存在，這些患者常表現(xiàn)為“α”決定簇內(nèi)的點(diǎn)突變或Pre-S缺失突變；與HBsAg陽(yáng)性的常規(guī)模式比較，28例HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性的慢性HBV感染者體內(nèi)HBV Pre-S區(qū)缺失突變更易發(fā)生（HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性的突變率為25.0%，HBsAg陽(yáng)性常規(guī)模式的突變率為3.6%）。他們的研究結(jié)果還顯示，血清HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性患者體內(nèi)HBV S蛋白的N-末端和MHR出現(xiàn)高頻突變，尤其在“α”決定簇存在較多的氨基酸替換，最常見的位點(diǎn)為S126。

HBV的隱匿性感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）特指患者血清HBsAg陰性，HBsAb、乙型肝炎核心抗體（hepatitis B core antibody，HBcAb）等陽(yáng)性，可檢測(cè)到低水平HBV DNA（一般＜200 IU/mL）或肝組織檢測(cè)出HBsAg或乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）。許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究均證實(shí)OBI具有傳染性，可通過(guò)再激活、輸血或器官移植等發(fā)展成典型的乙肝，最終發(fā)展為慢性乙肝、肝硬化和肝細(xì)胞性肝癌。OBI發(fā)生的機(jī)制還未完全清楚，HBV低水平復(fù)制、抗原表達(dá)量低、HBV基因變異、宿主免疫應(yīng)答異常等均可導(dǎo)致OBI。最受關(guān)注的是HBV S區(qū)基因的變異，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。我國(guó)是HBV的高流行國(guó)，很多學(xué)者對(duì)OBI與HBV S區(qū)基因變異的關(guān)系進(jìn)行了大量研究。郭燕等[10]研究了38例OBI患者，其中8例完成了HBV Pre-S/S區(qū)基因測(cè)序；OBI毒株MHR中氨基酸的變異率顯著高于野毒株，在“α”決定簇檢測(cè)到I126T、Q129R、M133T、F134I、D144E和G145K突變。黃象艷等[11]研究了10例OBI慢性乙肝患者，8例患者感染的HBV存在不同S區(qū)基因的突變或突變株與野生株的混合感染；突變頻率較高的位點(diǎn)為T47A、L98V、I/T126N/S、T131N、M133T/I等。LIAO等[12]的研究結(jié)果顯示，在陜西省寶雞地區(qū)獻(xiàn)血者中OBI約占0.054%；對(duì)43例OBI患者的HBV Pre-S/S區(qū)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)OBI毒株MHR的突變率顯著高于慢性乙肝病毒株；突變位點(diǎn)主要見于S117T、T118K、T131N、 T134Y/L和D144E，Pre-S區(qū)還出現(xiàn)＞33個(gè)堿基對(duì)的缺失。

2 臨床常用HBsAg檢測(cè)試劑的不足

我國(guó)HBsAg的檢測(cè)方法主要為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CIA）。ELISA試劑盒大部分可用于血液HBsAg的篩查，檢測(cè)敏感性已較高。由于檢測(cè)方法主要采用雙抗體夾心法，作為檢測(cè)抗體和捕獲抗體的HBsAb主要的結(jié)合位點(diǎn)是HBsAg的“α”決定簇。因此，“α”決定簇內(nèi)的氨基酸置換可引起HBsAg蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，使檢測(cè)抗體或捕獲抗體與變異的HBsAg結(jié)合力降低或無(wú)法識(shí)別，造成漏檢。HUANG等[13]采用國(guó)內(nèi)常用的檢測(cè)HBsAg的4種ELISA試劑（新創(chuàng)、科華、萬(wàn)泰和Murex）和2種主流CIA（雅培和羅氏）檢測(cè)7例疑似OBI的慢性乙肝患者血清，這4種ELISA試劑均為輸血篩查試劑，與CIA一樣，具有較高的檢測(cè)敏感性。他們的研究結(jié)果顯示，7份樣本用新創(chuàng)試劑檢測(cè)均為陰性，科華和萬(wàn)泰的試劑檢測(cè)僅1份陽(yáng)性，Murex試劑檢測(cè)有5份樣本陽(yáng)性；用雅培CIA檢測(cè)有3份樣本陽(yáng)性；用羅氏CIA檢測(cè)7份樣本均為陽(yáng)性。由此可見，HBsAg檢測(cè)試劑的敏感性和對(duì)變異抗原的識(shí)別捕獲能力在檢測(cè)HBsAg中非常重要。國(guó)產(chǎn)ELISA試劑盒與同為ELISA原理的Murex試劑相比，存在一定的差異。藍(lán)海云等[14]使用adw、adr和ay 3種國(guó)家參考物質(zhì)及真核表達(dá)的分別含G144A、Q129R/M133T、T118K/P120Q和G145R 4種變異的HBsAg作為檢測(cè)樣本，評(píng)價(jià)了14種HBsAg檢測(cè)試劑盒（6種進(jìn)口、8種國(guó)產(chǎn)）對(duì)野生型和突變型HBsAg的檢測(cè)能力。他們的研究結(jié)果顯示，對(duì)于野生型HBsAg，國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口試劑的檢測(cè)能力無(wú)差異；對(duì)于血清型adw和adr，國(guó)產(chǎn)試劑的檢測(cè)低限已達(dá)0.1 IU/mL；對(duì)于血清型ay，國(guó)產(chǎn)試劑的檢測(cè)低限已達(dá)0.2 U/mL；對(duì)于Q129R/M133T突變型HBsAg，國(guó)產(chǎn)試劑的敏感性與進(jìn)口試劑相差20倍以上；國(guó)產(chǎn)試劑對(duì)T118K/P120Q突變HBsAg出現(xiàn)漏檢，且進(jìn)口試劑的敏感性高于國(guó)產(chǎn)試劑；國(guó)產(chǎn)試劑和進(jìn)口試劑對(duì)G145R突變HBsAg的敏感性一致。進(jìn)口ELISA試劑對(duì)于突變HBsAg的檢測(cè)敏感性高于進(jìn)口CIA試劑；國(guó)產(chǎn)試劑對(duì)于突變HBsAg的檢測(cè)能力需進(jìn)一步提高。YANG等[15]采用10種商品化HBsAg試劑盒檢測(cè)了1份來(lái)自獻(xiàn)血者的血樣，10種ELISA試劑盒中有8種檢測(cè)結(jié)果為陰性，HBV DNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)在S區(qū)出現(xiàn)2個(gè)天然突變位點(diǎn)，即nt 353A變?yōu)門和nt 349T變?yōu)锳，導(dǎo)致氨基酸出現(xiàn)T118M和K122N替換；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)是T118M的氨基酸替換造成了8種商品化ELISA試劑盒檢測(cè)HBsAg的漏檢；將該突變氨基酸恢復(fù)后，也恢復(fù)了這8種ELISA試劑盒的檢測(cè)能力。

3 造成HBsAg漏檢的可能機(jī)制和原因

目前，學(xué)者們認(rèn)為導(dǎo)致HBsAg漏檢的原因是多方面的，其中最主要的原因是HBV Pre-S/S區(qū)基因的突變。

3.1 HBV Pre-S/S區(qū)基因突變和氨基酸置換導(dǎo)致HBsAg的抗原性及表達(dá)降低

“α”決定簇內(nèi)或臨近單個(gè)或多個(gè)序列位點(diǎn)的變異均可引起HBsAg構(gòu)象表位發(fā)生改變，從而影響抗原和抗體的結(jié)合反應(yīng)[16]。S126是最常見的Pre-S/S區(qū)突變位點(diǎn)?，F(xiàn)已證實(shí)T126S突變導(dǎo)致的氨基酸置換可明顯降低HBsAg的抗原性，導(dǎo)致HBV出現(xiàn)免疫逃逸和HBsAg漏檢[6]。S145位點(diǎn)突變的流行率為2.3%，包括G145R和G145A[6]。G145R突變是目前研究最多、報(bào)道最廣泛的Pre-S/S區(qū)突變。G145R突變能改變“α”決定簇內(nèi)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使相應(yīng)的抗體不能被充分識(shí)別[17]。ZHANG等[18]使用9個(gè)HBV S區(qū)基因突變載體轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞載體，轉(zhuǎn)染Huh7或HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染I/T126V伴G145R、氨基酸122-123位插入K-S-T-G-L-C-K短肽伴G129N突變體細(xì)胞的上清液中未檢出HBsAg，轉(zhuǎn)染I/T126V和Q129N伴G145R突變體的上清液中HBsAg水平顯著下降；這些突變體表達(dá)的融合蛋白的抗原性僅為1.66%～63.83%，明顯低于野生型。S133的突變率約為2.8%，存在3種突變類型：M133L、M133T和M133S；其中M133L僅在HBV的B基因型中被發(fā)現(xiàn)，M133S則存在于C基因型中，M133T突變可產(chǎn)生新糖基化位點(diǎn)T131N，新糖基化位點(diǎn)通過(guò)模擬B細(xì)胞表位的作用干擾HBsAg的識(shí)別[19]。有研究結(jié)果顯示，G145R突變可以明顯降低HBV的復(fù)制、減少HBsAg的表達(dá)，從而影響對(duì)HBsAg的檢測(cè)[20]。使用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建G145A突變體并轉(zhuǎn)染Huh7和HepG2細(xì)胞，與野生型相比較，轉(zhuǎn)染G145A突變體的細(xì)胞上清液中的HBsAg水平顯著降低[21-22]。ZHANG等[18]的研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染I/T126V突變體或I/T126V伴G145R突變體的細(xì)胞內(nèi)和上清液中的HBsAg水平均明顯低于野生型，而轉(zhuǎn)染Q129N伴G145R突變體HBsAg水平僅中度降低。

3.2 HBV基因組Pre-S/S區(qū)突變和氨基酸置換對(duì)HBsAg分泌的影響

XIANG等[8]的研究結(jié)果顯示，HBV基因組Pre-S/S區(qū)E2G、L21R、G24K、T47A/K、C69stop、L95W、L98V和G145R突變與HBsAg水平呈負(fù)相關(guān)；與野生型相比，E2G、C69stop、L95W、L98V和G145R突變使細(xì)胞外HBsAg水平顯著降低，而細(xì)胞內(nèi)HBsAg水平僅稍有降低；然而，突變型轉(zhuǎn)染細(xì)胞的HBV總RNA和未轉(zhuǎn)染前基因組RNA水平與野生型無(wú)明顯差異。由此可見，Pre-S/S區(qū)突變引起的氨基酸置換未影響HBsAg轉(zhuǎn)錄，但HBsAg分泌受損。W172R和W182L突變型幾乎可完全阻滯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌HBsAg[23]。T118K、 K141E、D144G、C147R和C149R突變可嚴(yán)重?fù)p傷HBV的分泌[24]。

3.3 HBV基因組可整合到宿主染色體中

HBV侵入人體后將基因組整合到宿主DNA上，約有75%以上的OBI肝細(xì)胞癌（HCC）或HBsAg陽(yáng)性HCC患者在染色體DNA中發(fā)現(xiàn)整合的HBV DNA，其常以不完整的DNA片段整合到宿主DNA的不同位置，以HBV X基因和Pre-S/S序列為多見；這種整合破壞了HBV和宿主基因組的完整性，導(dǎo)致HBsAg不表達(dá)或無(wú)法被識(shí)別[25-26]。

3.4 HBsAg檢測(cè)試劑的敏感性

目前，國(guó)產(chǎn)HBsAg試劑盒的敏感性準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)達(dá)到0.5 ng/mL，進(jìn)口CIA試劑已達(dá)到0.2 ng/mL。HBsAg檢測(cè)的敏感性與待檢樣本中HBV的基因型和血清型密切相關(guān)，不同亞型間的檢測(cè)敏感性可相差10倍以上[24]。盡管目前國(guó)產(chǎn)試劑對(duì)HBsAg的檢測(cè)敏感性在不斷提升，但對(duì)于Pre-S/S區(qū)突變抗原的檢測(cè)能力仍需進(jìn)一步提高。

4 問(wèn)題與展望

HBV Pre-S/S區(qū)突變導(dǎo)致的HBsAg漏檢對(duì)于輸血安全及乙肝診斷、治療評(píng)估等的危害性是不言而喻的。發(fā)生突變的HBV易產(chǎn)生免疫逃逸。易引起漏檢的“熱點(diǎn)”突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及其病理生理機(jī)制的闡明，為改進(jìn)HBsAg檢測(cè)試劑的分析性能奠定了基礎(chǔ)。目前，對(duì)于廣泛報(bào)道的S145位點(diǎn)突變已研究得較為深入，大部分HBsAg檢測(cè)試劑盒已能捕獲此類型的突變株。但還應(yīng)針對(duì)我國(guó)流行的HBV Pre-S/S區(qū)突變“熱點(diǎn)”位點(diǎn)，如S120、S126、S129等加大力度研發(fā)檢測(cè)試劑，同時(shí)提高檢測(cè)的敏感性，以減少HBsAg的漏檢。